راهنمای جامع تکنیک PCR

اصول، روش ها و کاربردهای مختلف تکنیک PCR 

در این مقاله آموزشی یاد می گیریم که تکنیک PCR چیست؟ مراحل و پروتکل انجام آزمایش به چه صورتی است؟ کاربرد انواع PCR در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی چیست؟

تکنیک PCR، روشی غیر کلون سازی است که مقادیر نامحدودی از توالی موردنظر را تکثیر می کند. این آزمایش برای بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در مخلوطی از DNA ها، تشخیص های قبل از تولد(تعیین جنسیت، بیماری ها) و… استفاده می شود.

در واقع تکنیک PCR همان همانندسازی در شرایط in vitro است. در واقع تکثیر آنزیمی یک قطعه از DNA که بین دو الیگونوکلئوتید (پرایمرها) قرار گرفته بنابراین باید با به کارگیری علم بیوانفورماتیک توالی اطراف قطعه مورد نظرمان را پیدا کنیم و با طراحی پرایمر برای آنها و اعمال سیکل های مکرر حرارتی قطعه را تکثیر کنیم.

بعد از انجام استخراج DNA، یک سری مواد و وسایل برای PCR لازم داریم از جمله بافر، آنزیم ،MgCl2 ،dNTP، پرایمر،آنزیم DNA پلیمراز Taq یا Pfu  مقاوم به حرارت و DNA الگو که همه ی این مواد و در تیوب مخصوص ریخته و در دستگاه ترموسایکلر که سیکل های مکرر حرارتی اعمال می کند قرار می دهیم.

مراحل یک سیکل PCR

به هر سیکل از PCR یک Stage گفته می شود که هر Stage(مرحله) شامل چندین Step(گام) می باشد.

مرحله  واسرشت یا دناتوراسیون (Denaturation Step): مرحله باز شدن دو رشته DNA، که در این مرحله دمای دستگاه را معمولا تا دمای 94 تا 98 درجه سانتیگراد بالا برده که این دما باعث گسستن پیوند های هیدروژنی دو رشته DNA و نهایتا دناتوره شدن مولکول می شود. حرارت در این مرحله به میزان نوکلئوتیدها در DNA بستگی دارد.

مرحله اتصال (Annealing Step): در این مرحله حرارت تا دمای 55-65 درجه سانتیگراد پایین می آید، در این مرحله پرایمرهای موجود در مخلوط واکنش در محل های خاصی از مولکول DNA اتصال پیدا می کنند. البته در این دما امکان دو رشته ای شدن مجدد DNA وجود دارد اما عمدتا این اتفاق رخ نمی دهد.

مرحله پليمريزاسيون یا طویل شدن (Extension/Elongation Step): در مرحله سوم دوباره دمای دستگاه تا 72 درجه سانتیگراد افزایش پیدا می کند که این دما مناسب ترین حرارت برای عملکرد صحیح آنزیم DNA پلیمراز Taq موجود در مخلوط واکنش است. در اینجا وظیفه آنزیم پلیمراز این است که به هر پرایمر بچسبد و از DNA الگو رشته جدیدی بسازد.

مراحل بعد در واکنش زنجیره ای پلیمراز در واقع تکرار تمام این مراحل از ابتدا تا انتها است به طوری که با تکرار به میزان 25 تا 40 چرخه، میزان DNA کپی شده می تواند به بیش از 130 میلیون مولکول DNA دو رشته ایی برسد.

مرحله طویل شدن نهایی (Final Elongation): این مرحله، پس از آخرین سیکل  PCR در دمای 72 درجه انجام می شود، تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNA همانند سازی شده اند.

نگهداری نهایی (Final hold): در این مرحله، محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای ۴ الی ۱۵ درجه قابل نگهداری است.

در نهایت می توانیم صحت انجام PCR را از طریق الکتروفورز در ژل آگارز یا پلی اکریل امید بررسی کنیم.

آشنایی با انواع PCR

تکنیک Conventional PCR

PCR سنتز قطعات خاص DNA را با استفاده از آنزیم DNA-پلیمراز، که در تکثیر ماده ژنتیکی سلولی شرکت می کند، امکان پذیر می کند. این آنزیم یک توالی مکمل از DNA را سنتز می کند، زیرا یک قطعه کوچک(پرایمر) به یکی از رشته های DNA در محل خاصی که برای شروع سنتز انتخاب شده است متصل می شود. پرایمرها توالی مورد تکرار را محدود می کنند و نتیجه تکثیر یک توالی DNA خاص با میلیاردها نسخه است. PCR معمولی در جداسازی انتخابی DNA، تکثیر و تعیین کمیت DNA، تشخیص بیماری های عفونی، مطالعات پزشکی قانونی و زمینه های تحقیقاتی استفاده می شود.

تکنیک RFLP PCR

تکنیک RFLP PCR روشی آسان و مقرون به صرفه است که به منظور تعیین ژنوتیپ واریانت‌ها و SNPهای داخل گونه‌ای و بین گونه‌ای استفاده می شود. نام دیگر این تکنیک که کمتر مورد استفاده قرار می گیرد CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) می باشد.

یکی از روش های تشخیص جهش ها و پلی مورفیسم ها در ژنوم، استفاده از آنزیم‌های محدودکننده است. اهمیت بررسی جهش ها در این است که ژنوم‌ موجودات‌ دارای‌ تفاوت‌هایی‌ در ردیف‌ بازهایشان هستند که این‌ تغییرات‌ طبیعی‌ که‌ باعث‌ گوناگونی‌ در افراد یک‌ جمعیت‌ می‌شود جهش یا پلی مورفیسم(تغییراتی که فراوانی یا فرکانس آن در جامعه بیشتر از 1% باشد) ‌را ایجاد می کنند. جهش‌ها از روش های گوناگونی می‌توانند منجر به تغییر در فنوتیپ اصلی و بروز صفات جدید یا بیماری ها شوند. به مطالعه شناسایی ارتباط جهش‌ها با بروز یک فنوتیپ خاص مطالعات همبستگی “Association Study” گفته می شود.

اگر یک جهش باعث از بین رفتن یا برعکس باعث به وجود آمدن جایگاه برش برای یک آنزیم محدودگر شود، از هضم آنزیمی یک قطعه به وسیله ی آن آنزیم می توانیم به حضور یا عدم حضور آن جهش پی ببریم.

• پروتکل انجام آزمایش PCR-RFLP

تکنیک ARMS PCR

ARMS PCR با نام کامل Amplification Refractory Mutation Syestem یک روش مطمئن و سریع برای شناسایی جهش های نقطه ای و پلی مورفیسم ها و حذف های کوچک است. از ARMS PCR می توان برای جداسازی آلل های یک ژن که حتی در حد یک جفت باز هستند و هم چنین برای تعیین ژنوتیپ و جدا کردن افراد هموزیگوت و هتروزیگوت از نظر یک لوکوس ژنی از هم استفاده کرد.

شناسایی جهش های تک نوکلئوتیدی در تشخیص پیش از تولد بیماری های ژنتیکی، تشخیص تومور در حین درمان و شناسایی افراد ناقل بیماری موثر است. با استفاده از این تکنیک 12 جهش متفاوت بر روی پروتیئن CFTR مربوط به بیماری فیبروز سیستیک(Cystic Fibrosis) قابل شناسایی می باشد. همچنین بررسی ژن JAK2 برای اختلالات احتمالی مغز استخوان با استفاده از ARMS PCR امکانپذیر می باشد.

هتروزیگوت یا همزیگوت با استفاده از آغازگرهای(پرایمرهای) ARMS PCR برای آلل های جهش یافته(پلی مورفیک) و نرمال متفاوت است. واکنش ها برای تشخیص جهش و آلل های معمولی معمولاً در لوله های جداگانه انجام می شود. اما می توان با استفاده از برچسب زدن دو پرایمر با رنگ های مختلف فلورسنت در همان لوله انجام شود.

• پروتکل انجام آزمایش ARMS PCR

تکنیک Tetra ARMS PCR

شناسایی SNP ها و جهش ها و انجام Association Study با استفاده از Tetra ARMs PCR امکان پذیر می باشد. در تکنیک Tetra ARMs PCR ما از 4 پرایمر به صورت همزمان برای یک واکنش استفاده می کنیم بنابراین نحوه طراحی پرایمر برای ما اهمیت زیادی دارد. طراحی پرایمر ها به گونه‌ای انجام می شود که بتوان دو واکنش PCR با پرایمر مختص الل نرمال و پرایمر مختص الل موتانت را هم زمان در یک واکنش PCR بررسی کرد.

مشخص شده است که SNP ها در شناسی علت بسیاری از بیماری های انسانی نقش دارند و در فارماکوژنتیک مورد توجه خاص قرار می گیرند. از آنجایی که SNP ها در طول تکامل حفظ می شوند، به عنوان نشانگرهایی برای استفاده در تجزیه و تحلیل مکان های صفت کمی (QTL) و در مطالعات ارتباطی به جای ریزماهواره ها پیشنهاد شده اند.

استفاده از SNP ها در پروژه HapMap نیز گسترش یافته است، که هدف آن ارائه حداقل مجموعه SNP های مورد نیاز برای ژنوتیپ ژنوم انسان است. SNP ها همچنین می توانند اثر انگشت ژنتیکی را برای استفاده در آزمایش هویت ارائه دهند. افزایش علاقه به SNP ها با توسعه طیف متنوعی از روش های ژنوتیپ SNP منعکس شده است.

• پروتکل انجام آزمایش Tetra ARMS PCR

تکنیک Multiplex PCR

تکنیک Multiplex PCR نخستین بار در سال 1988 برای شناسایی جهش های dystrophin استفاده شد و امروزه برای شناسایی SNP ها و میکروستلیت ها در انگشت نگاری DNA بسیار پرکاربرد می باشد. استفاده از این تکنیک زمان، هزینه و خطر آلودگی متقاطع را کاهش می دهد، زیرا جابجایی نمونه حداقل است.

در مطالعات چندین اگزون از یک ژن و بررسی جهش های موجود در آن ها لازم است چندین توالی اسیدهای نوکلئیک را تکثیر کنیم که برای انجام این کار از تکنیک Multiplex PCR استفاده می کنیم چرا که باعث صرفه جویی در زمان و هزینه می شود و روشی سریع و راحت در تشخیص پزشکی (به عنوان مثال تشخیص بیماری زایی دو سویه مختلف باکتریایی) و آزمایشات تحقیقاتی می باشد.

• پروتکل انجام آزمایش Multiplex PCR

تکنیک Touchdown PCR

اساس Touchdown PCR تغییر پارامترهای مربوط به هر سیکل است و تفاوت آن با PCR معمولی دو فاز جداگانه چرخه دمایی است، فاز اول فاز Touchdown نامیده می شود که با دمای اتصال بالاتر از Tmمعمول ( Tm+10°C) شروع و در حین سیکل های متوالی کاهش می یابد تا به دمای اتصال مورد نظر برسیم، سپس فاز دوم همان تکنیک PCR معمولی در این دماست.

پس می توان گفت درطی 10 تا 15 سیکل اولیه واکنش دماهای بالاتر از دمای اتصال (انلینگ) پیش بینی شده به کار می رود و به مرور کاهش می یابد تا به دمای Tmمورد نظر که همان دمای Touchdown به آن گفته می شود برسیم و سپس 25-20 سیکل با دمای اتصال مورد نظر انجام می گیرد باید دقت کرد که تعداد کلی سیکل ها بیشتر از 35 سیکل نشود چون خود این موضوع باعث افزایش تکثیر باندهای غیر اختصاصی و دایمرهای پرایمر می شود.

• پروتکل انجام آزمایش Touchdown PCR

تکنیک Nested PCR

تکنیک Long PCR

PCR متداول برای تکثیر قطعاتی از DNA که طولی کمتر از bp 1000 دارند بسیار کارآمد است اما هنگامی که طول قطعه بیشتر شود بازده PCR پایین آمده و برای بهینه سازی شرایط واکنش باید تلاش زیادی انجام داد. روش Long PCR همان PCR متداول است با این تفاوت که به جای استفاده از Taq پلیمراز از چندین DNA پلیمرازهای مقاوم به حرارت استفاده می‌شود.

در سال 1994 پژوهشگری به نام Barnes فرضیه هایی را ارائه داد که به روشی قابل اطمینان برای تکثیر توالی های طولانی تبدیل شد. او عقیده داشت که خطای Taq پلیمراز(DNA پلیمراز highly processive) در جهت ‘5 به ‘3 می باشد و خاصیت تصحیح اگزونوکلئازی(Exonuclease Proofreading) در جهت ‘3 به ‘5 را ندارد، باعث جفت شدن نادرست بازها و در نهایت کاهش راندمان تکثیر می شود و چنان چه این خطا در انتهای ‘3 توالی باشد تکثیر به اتمام نمی رسد.

• پروتکل انجام آزمایش Long PCR

تکنیک Digital PCR یا dPCR

در تکنیک Digital PCR یا (dPCR) از نظر مواد اولیه و مرحله تکثیر اسید نوکلئیک ها مشابه qPCR یا همان Real Time PCR می باشد، یعنی از شیوه های تشخیصی بر مبنای پروب های فلوئورسنت و روش تکثیر PCR استاندارد استفاده می شود و تنها تفاوت در این است که، در این روش میزان قطعی نوکلئیک اسیدهای نمونه مورد نظر، بدون نیاز به منحنی استاندارد و رفرنس ها به دست می آید.

در تکنیک qPCR سیگنال های آزاد شده از توالی های نادر مثل جهش های نقطه ای از سیگنال های آزاد شده از توالی طبیعی قابل تشخیص نیست چون توسط آن ها پوشانده می شود اما حساسیت در روش dPCR به گونه ای است که توالی های نادر هم در میان حجم زیادی از توالی طبیعی می توان تشخیص داد.

• پروتکل انجام آزمایش Digital PCR

تکنیک VNTR PCR

در ژنوم همه ما نواحی وجود دارد که بسیار متغیر و دارای توالی های تکراری است که به این نواحی VNTR یا مینی ستلایت (microsatellite ) گفته می شود که به طور عمده عملکرد ویژه ای ندارند. در حالت طبیعی VNTR ها دارای 20 تا 100 نوکلئوتید تکراری و پشت سرهم می باشند. که این طول و تعداد تکرارها در افراد مختلف به جز در دو قلوهای همسان، متفاوت است بنابراین می توان از آن ها به عنوان مارکری برای شناسایی DNA افراد استفاده کرد.

تکنیک VNTR-PCR، به معنای PCR نواحی VNTR در ژنوم به خاطر آنالیز و مقایسه ی آنها  هست که اساس تکنیک انگشت نگاری DNA می باشد که اولین بار توسط پروفسور Alec Jeffrey درسال 1984 معرفی گردید البته در  ابتدا VNTR ها توسط آنالیز RFLP شناسایی شدند.

• پروتکل انجام آزمایش تکنیک VNTR PCR

PCR اختصاصی متیلاسیون

این تکنیک در سال 1996 به وسیله Herman و همکارانش شناسایی و معرفی گردید. تکنیک MSP کاربرد گسترده در بررسی جزایر CpG پروموتر ها دارد و از دو بخش اصلی تشکیل شده است:

1- سیتوزین‌ های متیله‌ نشده در اثر سدیم بی‌سولفیت به یوراسیل تبدیل شده، در صورتی که سیتوزین‌ های متیله‌ شده تغییری نمی کنند.

2- بررسی تفاوت‌ های توالی تیمار شده با بی‌سولفیت تحت تاثیر PCR، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی هر دو نوع DNA متیله و غیرمتیله.

اساس کار قرار دادن توالی‌ های دارای CpG تحت تاثیر سدیم بی سولفیت است که به طور قطع الل‌هایی که CpG هایشان متیله هستند نسبت به آن‌ هایی که غیرمتیله هستند، توالی متفاوتی را حاصل خواهد کرد. سپس از دو جفت پرایمر اختصاصی توالی‌ های متیله شده و متیله نشده برای ژن موردنظر استفاده می کنیم که پرایمر متیله‌ نشده (UMP)، تنها مولکول DNA ای را که در اثر سدیم بی سولفیت تغییر کرده است را تکثیر می‌ کند در حالیکه، که پرایمر متیله‌ شده (MSP)، مخصوص DNA متیله شده تغییر یافته در اثر سدیم بی سولفیت می‌باشد.

• پروتکل انجام آزمایش MSP

تکنیک RT-PCR

تکنیک RT-PCR نمونه یک الگوی شروع واکنش تکثیر اسیدهای نوکلئیک به جای DNA مولکول RNA می باشد که به آن RT-PCR (Reverse transcription PCR) نیز گفته می شود. در بسیاری مواقع که ممکن است نمونه ای که می خواهیم تکثیر کنیم DNA نباشد مثلا برای بررسی عفونت با ویروس های RNA دار.

ساخت کتابخانه ژنی cDNA به منظور حذف نواحی غیر کننده و عناصر تنظیمی موجود در DNA ژنومی و کلون کردن و بیان ژن های یوکاریوتی در پروکاریوت ها و در نهایت مهم ترین کاربرد آن این است که برای بررسی میزان بیان ژن ها به تعیین مقدار mRNA نیاز داریم که در واقع می توان گفت اولین گام برای انجام Real Time PCR، سنتز cDNA توسط  RT-PCR می باشد به دلیل اینکه آنزیم DNA پلیمرازی که برای سنتز رشته های جدید در انواع PCR استفاده می شود قادر به استفاده از RNA به عنوان الگو نیست.

اساس سنتز cDNA بر مبنای آنزیم نسخه بردار معکوس (Reverse transcriptase) می باشد که قابلیت سنتز DNA تک رشته ای از روی توالی RNA تک رشته ای را دارد و اولین بار در اوایل دهه 1970 از رتروویروس ها خارج شد که در واقع یک DNA پلیمراز وابسته به RNA  هست که چندین نوع از این آنزیم وجود دارد:AMV ، MMLV ،HIV-1  و آنزیم نسخه بردار معکوس تلومرازی.

• پروتکل انجام آزمایش RT-PCR

تکنیک Real Time PCR

تکنیک Real Time PCR(ریل تایم پی سی آر) که به آن Quantitative PCR یا PCR کمی نیز گفته می شود. به طور عمده بررسی بیان ژن با real time pcr انجام می شود، هر چند که در تعیین میزان ویروس های یک نمونه هم تکنیکی قوی و حساس به شمار می آید. این تکنیک کاربردهای فراوانی دیگری همچون بررسی میزان تأثیر دارو درمانی، سنجش آسیب های DNA، تشخیص عوامل بیماری زا، تعیین ژنوتیپ افراد، سنجش تفکیک شدن آللی و … دارد.

در روش Real Time PCR از یک مولکول گزارشگر فلوروسنت برای مشاهده پیشرفت PCR استفاده می شود و قدرت سیگنال فلوئورسنت تولید شده ارتباط مستقیمی با مقدار مولکول‌ های تکثیرشده دارد. در این روش میزان محصولاتی که حین یک آزمایش PCR تولید می‌ شوند با میزان محصولات تولید شده طی آزمایش‌ های PCR با مقدار نوکلئیک ‌اسید آغازکننده مشخص، مقایسه می‌شود و امکان پی بردن به مقدار نوکلئیک اسید اولیه موجود در نمونه، برای ما فراهم می شود.

برای یادگیری تکنیک PCR و سایر تکنیک های مورد نیاز برای آزمایشگاه ژنتیک مولکولی

از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.

برای دریافت خدمات مربوط به تکنیک PCR و انجام انواع تست های ژنتیک مولکولی

از طریق لینک خدمات آزمایشگاهی می توانید اقدام نمایید