راهنمای جامع تکنیک PCR

اصول، روش ها و کاربردهای مختلف تکنیک PCR در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی

در این مقاله جامع آموزشی قصد داریم به پاسخ سوالات زیر دست بیابیم.

PCR چیست و برای چه آزمایش هایی مورد استفاده قرار می گیرد؟ مراحل و پروتکل انجام آزمایش PCR به چه صورتی است؟ کاربرد انواع PCR در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی چیست؟

تکنیک PCR، روشی غیر از کلون سازی است که مقادیر نامحدودی از توالی موردنظر را تولید می کند. این آزمایش برای بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در مخلوطی از DNA ها، تشخیص های قبل از تولد(تعیین جنسیت، بیماری ها) و… استفاده می شود.

در واقع تکنیک PCR همان همانندسازی در شرایط in vitro است در واقع یعنی تکثیر آنزیمی یک قطعه از DNA که بین دو الیگونوکلئوتید (پرایمرها) قرار گرفته بنابراین باید با به کارگیری علم بیوانفورماتیک توالی اطراف قطعه مورد نظرمان را پیدا کنیم و با طراحی پرایمر برای آنها و اعمال سیکل های مکرر حرارتی قطعه را تکثیر کنیم.

بعد از انجام استخراج DNA، یک سری مواد و وسایل برای PCR لازم داریم مثل: بافر، آنزیم ،MgCl2 ،dNTP، پرایمر،آنزیم DNA پلیمراز Taq یا Pfu  مقاوم به حرارت و DNA الگو که همه ی این مواد و در تیوب مخصوص ریخته و در دستگاه ترموسایکلر که سیکل های مکرر حرارتی اعمال می کند قرار می دهیم.

مراحل یک سیکل PCR:

به هر سیکل از PCR یک Stage گفته می شود که هر Stage شامل چندین Step می باشد.

مرحله  واسرشت یا دناتوراسیون (Denaturation Step): مرحله باز شدن دو رشته DNA ، که در این مرحله دمای دستگاه را معمولا تا دمای 94 تا 98 درجه سانتیگراد بالا برده که این دما باعث گسستن پیوند های هیدروژنی دو رشته DNA  و نهایتا دناتوره شدن مولکول می شود. حرارت در این مرحله به میزان نوکلئوتیدها در DNA بستگی دارد.

مرحله اتصال (Annealing Step): در این مرحله حرارت تا دمای 55-65 درجه سانتیگراد پایین می آید ، در این مرحله پرایمرهای موجود در مخلوط واکنش در محل های ویژه ای از مولکول DNA اتصال پیدا می کنند. البته در این دما امکان دو رشته ای شدن مجدد DNA وجود دارد ولی عمدتا این اتفاق رخ نمی دهد.

مرحله پليمريزاسيون یا طویل شدن (Extension/Elongation Step): در مرحله سوم دوباره دمای دستگاه تا 72 درجه سانتیگراد افزایش پیدا می کند که این دما مناسب ترین حرارت برای عملکرد صحیح آنزیم DNA پلیمراز Taq موجود در مخلوط واکنش است. در اینجا وظیفه آنزیم پلیمراز این است که به هر پرایمر بچسبد و از DNA الگو رشته جدیدی بسازد.

مراحل بعد در واکنش زنجیره ای پلیمراز در واقع تکرار تمام این مراحل از ابتدا تا انتها است به طوری که با تکرار به میزان 25 تا 40 چرخه، میزان DNA کپی شده به بیش از 130 میلیون مولکول DNA دو رشته ایی می رسد.

مرحله طویل شدن نهایی (Final Elongation): این مرحله، پس از آخرین سیکل  PCR در دمای 72 درجه انجام می شود، تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNA همانند سازی شده اند.

نگهداری نهایی (Final hold): در این مرحله، محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای ۴ الی ۱۵ درجه قابل نگهداری است.

در نهایت می توانیم صحت انجام PCR را از طریق الکتروفورز در ژل آگارز یا پلی اکریل امید بررسی کنیم.

برای یادگیری تکنیک PCR و سایر تکنیک های مورد نیاز برای آزمایشگاه ژنتیک مولکولی

از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.

آشنایی با انواع PCR

تکنیک RFLP PCR

یکی از روشهای تشخیص جهش ها و پلی مورفیسم ها در ژنوم، که  تکنیک با استفاده از آنزیم‌های محدودکننده است. اهمیت بررسی جهش ها در این است که ژنوم‌ موجودات‌ دارای‌ تفاوت‌هایی‌ در ردیف‌ بازهاشان هستند که این‌ تغییرات‌ طبیعی‌ که‌ باعث‌ گوناگونی‌ در افراد یک‌ جمعیت‌ می‌شود چند شکلی‌ ژنتیکی یعنی همان جهش یا پلی مورفیسم(جهشی که فراوانی آن در جامعه بیشتر از 1% باشد) ‌نام‌ دارد.

جهش‌ها از روش های گوناگونی می‌توانند منجر به تغییر در فنوتیپ اصلی و بروز صفات جدید مثل بیماری یا سرطان شوند و به مطالعه شناسایی ارتباط جهش‌ها با بروز یک فنوتیپ خاص مطالعات همبستگی “association study” گفته می شود.

اگر یک جهش باعث از بین رفتن یا برعکس باعث به وجود آمدن جایگاه برش برای یک آنزیم محدودگر شود، از هضم آنزیمی یک قطعه به وسیله ی آن آنزیم می توانیم به حضور یا عدم حضور آن جهش پی ببریم.

• پروتکل انجام آزمایش PCR-RFLP

تکنیک ARMS PCR

ARMS PCR با نام کامل Amplification Refractory Mutation Syestem یک روش مطمئن و سریع برای شناسایی جهش های نقطه ای و پلی مورفیسم ها و حذف های کوچک است. از ARMS PCR می توان برای جداسازی آلل های یک ژن که حتی در حد یک جفت باز هستند و هم چنین برای تعیین ژنوتیپ و جدا کردن افراد هموزیگوت و هتروزیگوت از نظر یک لوکوس ژنی از هم استفاده کرد.

هتروزیگوت یا همزیگوت با استفاده از آغازگرهای(پرایمرهای) ARMS PCR برای آلل های جهش یافته / پلی مورفیک و نرمال متفاوت است. واکنش ها برای تشخیص جهش و آلل های معمولی معمولاً در لوله های جداگانه انجام می شود. اما می توان با استفاده از برچسب زدن دو پرایمر با رنگ های مختلف فلورسنت در همان لوله انجام شود.

• پروتکل انجام آزمایش ARMS PCR

تکنیک Tetra ARMS PCR

شناسایی SNP ها و جهش ها و انجام Association Study با استفاده از Tetra ARMs PCR امکان پذیر می باشد. در تکنیک Tetra ARMs PCR ما از 4 پرایمر به صورت همزمان برای یک واکنش استفاده می کنیم بنابراین نحوه طراحی پرایمر برای ما اهمیت زیادی دارد. طراحی پرایمر ها به گونه‌ای انجام می شود که بتوان دو واکنش PCR با پرایمر مختص الل نرمال و پرایمر مختص الل موتانت را هم زمان در یک واکنش PCR بررسی کرد.

• پروتکل انجام آزمایش Tetra ARMS PCR

تکنیک Multiplex PCR

Multiplex PCR یک روش زیست شناسی مولکولی گسترده به منظور تکثیر اهداف متعدد در یک آزمایش PCR است. در Multiplex PCR باید پرایمرها و شرایط واکنش بهینه شوند.

در مطالعات چندین اگزون از یک ژن و بررسی جهش های موجود در آن ها لازم است چندین توالی اسید های نوکلئیک را تکثیر کنیم که برای انجام این کار از تکنیک Multiplex PCR استفاده می کنیم. برای این کار بهترین راه استفاده از تکنیک Multiplex PCR است که باعث صرفه جویی در زمان و هزینه می شود و روشی سریع و راحت در تشخیص پزشکی (به عنوان مثال تشخیص بیماری زایی دو سویه مختلف باکتریایی) و آزمایشات تحقیقاتی می باشد.

• پروتکل انجام آزمایش Multiplex PCR

تکنیک Touchdown PCR

اساس Touchdown PCR تغییر پارامترهای مربوط به هر سیکل است و تفاوت آن با PCR معمولی دو فاز جداگانه چرخه دمایی است، فاز اول فاز Touchdown نامیده می شود که با دمای اتصال بالاتر از Tmمعمول ( Tm+10°C) شروع و در حین سیکل های متوالی کاهش می یابد تا به دمای اتصال مورد نظر برسیم، سپس فاز دوم همان تکنیک PCR معمولی در این دماست.

پس می توان گفت درطی 10 تا 15 سیکل اولیه واکنش دماهای بالاتر از دمای اتصال (انلینگ) پیش بینی شده به کار می رود و به مرور کاهش می یابد تا به دمای Tmمورد نظر که همان دمای Touchdown به آن گفته می شود برسیم و سپس 25-20 سیکل با دمای اتصال مورد نظر انجام می گیرد باید دقت کرد که تعداد کلی سیکل ها بیشتر از 35 سیکل نشود چون خود این موضوع باعث افزایش تکثیر باندهای غیر اختصاصی و دایمرهای پرایمر می شود.

• پروتکل انجام آزمایش Touchdown PCR

تکنیک Long PCR

در PCR عادی برای تکثیر قطعاتی از DNA که طولی کمتر از 1000 bp دارند بسیار کارآمد است ولی وقتی این طول بیشتر شود بازده PCR پایین آمده و باید تلاش زیادی برای بهینه سازی شرایط واکنش انجام داد. در سال 1994 محققی به نام Barnes فرضیه هایی را ارائه داد که به روشی قابل اطمینان برای تکثیر توالی های طولانی تبدیل شد.

او عقیده داشت که خطای Taq DNA  پلیمراز که یک DNA  پلیمراز highly processive در جهت ‘5 به ‘3 می باشد و خاصیت تصحیح اگزونوکلئازی (exonuclease proofreading) در جهت ‘3 به ‘5 را ندارد، باعث جفت شدن نادرست بازها و در نهایت کاهش راندمان تکثیر می شود و چنان چه این خطا در انتهای ‘3 توالی باشد تکثیر به اتمام نمی رسد. برای رفع این مشکل می توان ازDNA  پلیمرازهای مقاوم به حرارت مثل Pwo ، Pfu و Vent که خاصیت تصحیح اگزونوکلئازی در جهت ‘3 به ‘5 دارند استفاده کرد.

• پروتکل انجام آزمایش Long PCR

تکنیک Digital PCR یا dPCR

تکنیک Digital PCR یا dPCR یک روش دقیق با حساسیت بالا جهت تعیین میزان DNA و RNA موجود در نمونه ها است. تکنیک Digital PCR یا (dPCR) از نظر مواد اولیه و مرحله تکثیر اسید نوکلئیک ها مشابه qPCR یا همان Real Time PCR می باشد، یعنی از شیوه های تشخیصی بر مبنای پروب های فلوئورسنت و روش تکثیر PCR استاندارد استفاده می شود و تنها تفاوت در این است که، در این روش میزان قطعی نوکلئیک اسیدها ی نمونه مورد نظر، بدون نیاز به منحنی استاندارد و رفرنس ها به دست می آید.

• پروتکل انجام آزمایش Digital PCR

PCR اختصاصی متیلاسیون (MSP)

این تکنیک در سال 1996 به وسیله Herman و همکارانش شناسایی و معرفی گردید. تکنیک MSP کاربرد گسترده در بررسی جزایر CpG پروموتر ها دارد و از دو بخش اصلی تشکیل شده است:

1- سیتوزین‌ های متیله‌ نشده در اثر سدیم بی‌سولفیت به یوراسیل تبدیل شده، در صورتی که سیتوزین‌ های متیله‌ شده تغییری نمی کنند.

2- بررسی تفاوت‌ های توالی تیمار شده با بی‌سولفیت تحت تاثیر PCR، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی هر دو نوع DNA متیله و غیرمتیله.

اساس کار قرار دادن توالی‌ های دارای CpG تحت تاثیر سدیم بی سولفیت است که به طور قطع الل‌هایی که CpG هایشان متیله هستند نسبت به آن‌ هایی که غیرمتیله هستند، توالی متفاوتی را حاصل خواهد کرد. سپس از دو جفت پرایمر اختصاصی توالی‌ های متیله شده و متیله نشده برای ژن موردنظر استفاده می کنیم که پرایمر متیله‌ نشده (UMP)، تنها مولکول DNA ای را که در اثر سدیم بی سولفیت تغییر کرده است را تکثیر می‌ کند در حالیکه، که پرایمر متیله‌ شده (MSP)، مخصوص DNA متیله شده تغییر یافته در اثر سدیم بی سولفیت می‌باشد.

• پروتکل انجام آزمایش MSP

تکنیک RT-PCR جهت سنتز cDNA

تکنیک RT-PCR نمونه یک الگوی شروع واکنش تکثیر اسیدهای نوکلئیک به جای DNA مولکول RNA می باشد که به آن RT-PCR (Reverse transcription PCR) نیز گفته می شود. در بسیاری مواقع که ممکن است نمونه ای که می خواهیم تکثیر کنیم DNA نباشد مثلا برای بررسی عفونت با ویروس های RNA دار.

ساخت کتابخانه ژنی cDNA به منظور حذف نواحی غیر کننده و عناصر تنظیمی موجود در DNA ژنومی و کلون کردن و بیان ژن های یوکاریوتی در پروکاریوت ها و در نهایت مهم ترین کاربرد آن این است که برای بررسی میزان بیان ژن ها به تعیین مقدار mRNA نیاز داریم که در واقع می توان گفت اولین گام برای انجام Real Time PCR، سنتز cDNA توسط  RT-PCR می باشد به دلیل اینکه آنزیم DNA پلیمرازی که برای سنتز رشته های جدید در انواع PCR استفاده می شود قادر به استفاده از RNA به عنوان الگو نیست.

اساس سنتز cDNA بر مبنای آنزیم نسخه بردار معکوس (Reverse transcriptase) می باشد که قابلیت سنتز DNA تک رشته ای از روی توالی RNA تک رشته ای را دارد و اولین بار در اوایل دهه 1970 از رتروویروس ها خارج شد که در واقع یک DNA پلیمراز وابسته به RNA  هست که چندین نوع از این آنزیم وجود دارد:AMV ، MMLV ،HIV-1  و آنزیم نسخه بردار معکوس تلومرازی.

• پروتکل انجام آزمایش RT-PCR

Types of PCR-definition and uses

برای دریافت خدمات مربوط به تکنیک PCR و انجام انواع تست های ژنتیک مولکولی

از طریق لینک خدمات آزمایشگاهی می توانید اقدام نمایید