شناسایی SNP ها و جهش ها و انجام Association Study با استفاده از تکنیک Tetra ARMS PCR
در روش Tetra ARMS PCR از 4 پرایمر به صورت همزمان برای یک واکنش استفاده می کنیم. طراحی پرایمر ها به گونهای انجام می شود که بتوان دو واکنش PCR با پرایمر مختص الل نرمال و پرایمر مختص الل موتانت را هم زمان در یک واکنش PCR بررسی کرد.
چند شکلی های تک نوکلئوتیدیSingle Nucleotide Polymorphisms (SNPs)، تغییرات و تنوع های طبیعی توالی با دانسیته بالا در ژنوم ها هستند. SNPها در واقع یک منبع ژنتیکی عمده از تغییرفنوتیپی درون یک گونه در نظر گرفته می شوند. SNP ها یکی از رایج ترین انواع تنوع ژنتیکی هستند. SNP یک جهش تک جفت باز در یک مکان خاص است که معمولاً از دو آلل تشکیل شده است.
مشخص شده است که SNP ها در شناسی علت بسیاری از بیماری های انسانی نقش دارند و در فارماکوژنتیک مورد توجه خاص قرار می گیرند. از آنجایی که SNP ها در طول تکامل حفظ می شوند، به عنوان نشانگرهایی برای استفاده در تجزیه و تحلیل مکان های صفت کمی (QTL) و در مطالعات ارتباطی به جای ریزماهواره ها پیشنهاد شده اند.
استفاده از SNP ها در پروژه هپ مپ(HapMap Project) نیز گسترش یافته است، که هدف آن ارائه حداقل مجموعه SNP های مورد نیاز برای ژنوتیپ ژنوم انسان است. SNP ها همچنین می توانند اثر انگشت ژنتیکی را برای استفاده در آزمایش هویت ارائه دهند. افزایش علاقه به SNP ها با توسعه طیف متنوعی از روش های ژنوتیپ SNP منعکس شده است.
روش کار/پروتکل تکنیک Tetra ARMS PCR
در Tetra ARMS PCR باید ابتدا یک جفت پرایمر بیرونی Outer Forward و Outer Reverse برای ناحیه ی دو طرف جهش البته با فاصله ی متفاوت از جهش مورد نظرمان طراحی کنیم زیرا اگر جهش در میان دو پرایمر باشد شناسایی درمراحل بعدی برای ما غیر ممکن می شود.
سپس 2 پرایمر داخلی (Inner Forward و Inner Reverse) را طراحی می کنیم که انتهای 3′ آن ها دقیقا SNP مورد نظر ما باشد به گونه ای که مثلا به صورت قراردادی برای درک بهتر انتهای 3′ پرایمر Inner Forward، نوکلئوتید مکمل آلل موتانت و انتهای 3′ پرایمر Inner Reverse، نوکلئوتید مکمل آلل نرمال می باشد. حال هر 4 پرایمر طراحی شده را در یک ویال حاوی DNA نمونه می ریزیم و در دستگاه ترموسایکلر انجام می دهیم.
با توجه به پرایمرهای ذکر شده سه محصول میتوانند تکثیر شوند
محصول اول، محصول حاصل از تکثیر قطعه بین پرایمرهای (outer forward) و پرایمر(outer reverse) می باشد. این قطعه تکثیر شده باید در هر دو توالی حاوی آلل موتانت و توالی حاوی آلل نرمال مشاهده شود. و در واقع به عنوان کنترلی برای صحت PCR به کار میرود.
محصول دوم، محصول حاصل از تکثیر قطعه بین پرایمرهای (outer forward) و پرایمر (Inner reverse) می باشد. به دلیل اینکه پرایمر (Inner reverse) طبق مثال قرار دادی مان تنها به توالی الل نرمال متصل میشود، بنابراین این قطعه تکثیر شده باید تنها در توالی دارای آلل نرمال دیده شود.
محصول سوم، محصول حاصل از تکثیر قطعه بین پرایمرهای (inner forward) و پرایمر(outer reverse) می باشد. به دلیل این که طبق مثال ذکر شده (inner forward) تنها به توالی دارای الل موتانت متصل میشود، بنابراین این قطعه تکثیر شده فقط باید در توالی دارای آلل موتانت مشاهده شود .
نحوه تعیین ژنوتیپ
از تفاوت طولی که محصولات با هم دارند با بردن آن ها روی ژل آگارز بالای 2% و ژل پلی آکریل آمید می توان به راحتی ژنوتیپ را تعیین کرد. افراد هموزیگوت نرمال یا موتانت فقط 2 محصول را روی ژل نشان می دهند که با توجه به پرایمرهایی که طراحی کردیم و تفاوت طولشان می توان تشخیص داد که فرد کدام یک ازآن هاست، ولی؛ افراد هتروزیگوت که در واقع هر دو آلل نرمال و موتانت را با خود حمل می کنند 3 باند را روی ژل به ما نشان می دهند.
بیشتر بخوانید:
-
Guidelines for the tetra-primer ARMS-PCR technique development
- راهنمای جامع تکنیک PCR | اصول، روش ها و کاربردهای مختلف در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی
برای یادگیری تکنیک های مورد نیاز برای کار در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.
سلام
اینکه ژل آگارز را در این روش با چه درصدی درست کنیم به چه عواملی مربوط میباشد؟
سلام
این موضوع به پرایمر طراحی شده بستگی دارد. هر چه اختلاف تعداد نوکلئوتیدهای پرایمرها نسبت به هم کمتر باشد، از ژل با درصد کمتر می توان استفاده کرد. بنابراین از لحاظ اقتصادی می تواند به صرفه تر و بهتر باشد.