اساس و کاربرد تکنیک Touchdown PCR در آزمایشگاه
در آزمایشگاه مولکولی گاها این اتفاق افتاده که باندهای غیر اختصاصی به جز باند مورد نظر طی PCR تکثیر شده و آن را روی ژل الکتروفورز مشاهده کرده ایم. راه حل های زیادی برای حذف این باندهای غیر اختصاصی وجود دارد تا PCR بهینه شود. از متدهای مختلف می توان اضافه کردن برخی مواد مانند DMSO، تغییر درغلظت یون منیزیم و تغییر پرایمرها و …اشاره کرد اما قبل از این ها می توان برای جلوگیری از اتلاف زمان و مواد مختلف برای ممانعت از اتصال نادرست پرایمرها و محدودیت در تعیین دقیق Tm از Touchdown PCR استفاده کرد.
Touchdown PCR نخستین بار در سال 1991 مطرح گردید. اساس تکنیک Touchdown PCR تغییر پارامترهای مربوط به هر سیکل است و تفاوت آن با PCR معمولی دو فاز جداگانه چرخه دمایی است، فاز اول فاز Touchdown نامیده می شود که با دمای اتصال بالاتر از TM یعنی (Tm+10°C) شروع و در حین سیکل های متوالی کاهش می یابد تا به دمای اتصال مورد نظر برسیم. در واقع استفاده از این تکنیک کمک می کند تا با کاهش متوالی دما، احتمال اتصال غیراختصاصی را کاهش دهیم.
سپس فاز دوم همان تکنیک PCR معمولی دراین دماست. بنابراین می توان گفت درطی 10 تا 15 سیکل اولیه واکنش دماهای بالاتر از دمای اتصال annealing پیش بینی شده به کار می رود و به مرور کاهش می یابد تا به دمای Tmمورد نظر که همان دمای Touchdown به آن گفته می شود برسیم و سپس 25-20 سیکل با دمای اتصال مورد نظر انجام می گیرد. باید دقت کرد که تعداد کلی سیکل ها بیشتر از 35 سیکل نشود چرا که خود این موضوع باعث افزایش تکثیر باندهای غیر اختصاصی و دایمرهای پرایمر می شود.
دماهای بالایی که در سیکل های ابتدایی استفاده می کنیم احتمال اتصال پرایمرها به نواحی از توالی الگو که بیشترین میزان مکمل بودن را دارند افزایش می دهد و در نتیجه دایمرهای پرایمر و اتصالات غیراختصاصی به حداقل می رسد ولی مشکل این دمای بالا افزایش احتمال جدا شدن پرایمرها از توالی مورد نظر و کاهش محصول است. کاهش دما به صورت تدریجی در سیکل های بعدی با استفاده از محصولات اختصاصی تولید شده در ابتدای واکنش مانع از کاهش محصول می شود و در نهایت با پیشرفت واکنش این محصولات اختصاصی بر محصولات غیر اختصاصی و دایمرهای پرایمر غلبه می کنند.
Stepdown PCR نیز تکنیکی مشابه Touchdown PCR است، با این تفاوت که دامنه میزان کاهش دمای اتصال در هر چرخه است بیشتر است. این روش به عنوان جایگزینی برای Touchdown PCR و به منظور رفع مشکل طولانی بودن تنظیم دستی تغییرات دمایی طراحی شد اما دستگاه های ترمال سایکلر جدید دارای امکان افزایش و یا کاهش دمای اتصال در هر چرخه را دارند بنابراین استفاده از این روش منسوخ شد.
- زمانی که رشته الگو DNA غنی از بازهای GC باشد با تلفیق روش Hot Start با Touchdown می توان نتیجه بهتری گرفت. همچنین با ترکیب روش مالتی پلکس(Multiplex PCR) با تاچ داون(Touchdown)، اتصالات غیراختصاصی در مالتی پلکس می توانند به حداقل برسند.
مزایا و معایب Touchdown PCR
هدف نهایی هر آزمایش PCR افزایش بازده و دقت نتایج است که TD-PCR هر دو را دارد. Touchdown PCR ظرفیت تشکیل پرایمر-دایمر پرایمرها را کاهش می دهد. با کاهش اتصالات غیر اختصاصی و ناخواسته پرایمر به DNA الگو، ویژگی بهتری را ارائه می دهد و در الگوهایی که محتوای GC بالاتری دارند بسیار مفید است. همچنین در زمان واکنش صرفه جویی می کند. اگرچه Touchdown PCR بسیار اختصاصی است اما اگر به خوبی انجام نشود، نیز نتایج غیر اختصاصی می دهد.
بیشتر بخوانید:
برای یادگیری تکنیک های مورد نیاز برای کار در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.