روشی بر اساس هضم شیمیایی و بدون نیاز به پلیمریزاسیون قطعه مورد نظر
تکنیک توالی یابی ماکسام گیلبرت که از روش های نسل اول توالی یابی است در سال ۱۹۷۶–۱۹۷۷ توسط الن مکسام و والتر گیلبرت جهت تعیین توالی DNA ابداع گردید. مقاله آلن ماکسام و والتر گیلبرت در سال 1977 با عنوان “روش جدیدی برای تعیین توالی DNA” توسط انجمن شیمی آمریکا در سال 2017 مورد تقدیر قرار گرفت. این مقاله به دپارتمان زیست شناسی سلولی و مولکولی دانشگاه هاروارد ارائه شد.
این تکنیک 2 سال پس از روش توالی یابی سنگر معرفی گردید و به سرعت محبوب تر شد زیرا در این تکنیک بر خلاف روش سنگر، به وکتور DNA تک رشته ای و پرایمر نیاز نبود و DNA تخلیص شده می توانست به طور مستقیم استفاده گردد. به این روش، روش تخریب شیمیایی یا روش End-labeling می گویند که با استفاده از آنزیم عملی می شود.
مراحل انجام تکنیک توالی یابی ماکسام-گیلبرت:
1- ابتدا فسفات انتهایی قطعه DNA توسط آنزیم فسفاتاز روده گوساله برداشته شده و به جای آن یک گروه فسفات(P32) نشاندار که خاصیت رادیواکتیو دارد، را با آنزیم پلی نوکلئوتید کیناز قرار می دهند.
2- در حضور دی متیل سولفوکسید(DMSO) و دمای 90 درجه سانتی گراد قطعه DNA تک رشته ایجاد کرده و با الکتروفورز ژلی ازهم جدا می کنند.
3- تنها رشته ای که یک انتهای آن با فسفات رادیواکتو ليبل شده است به وسیله ی اتو رادیوگراف ظاهر شده و از روی ژل تخليص گشته را به 4 لوله مجزا تقسیم کرده و هر کدام را با یک ماده تخریبگر خاص مجاورمی کنند. اسید فرمیک ۶۰ درصد منجر به شکسته شدن پیوندها از محل پورین ها(A+C) می شود در واقع پورین زدایی می شود، دی متیل سولفات باعث شکسته شدن و متیله شدن گوانین و تا حدی آدنین می شود، هیدرازین سبب شکستن پیوند از محل بازهای پیریمیدین (C+T) می شود و افزودن نمک کلرید سدیم NaCl به واکنش هیدرازین منجر به مهار واکنش تیمین برای واکنش C می‌شود.
سپس با افزودن پاپیریدین تخریب انجام می گیرد به طوری که در هر رشته فقط یک شکاف ایجاد می شود. در نهایت با الکتروفورز و اتورادیوگرافی توالی را مشخص می کنند.
جهت انجام اتورادیوگرافی برای نمایش و مرئی سازی بخش‌ها، ژل مورد نظر در معرض اشعه X قرار می‌گیرد تا نوارهای تیره‌ای را که بیانگر مکان مولکول رادیواکتیو شده است را نمایش دهد. از حضور یا غیبت برخی قسمت‌ها می‌توان توالی رشته را متوجه شد. به این ترتیب که اگر نواری در هر دو واکنش C+t و C باشد به این معنی است که در آن مکان باز C قرار دارد. اگر تنها در C+t نواری داشته باشیم یعنی در آن محل باز T خواهیم داشت. به صورت مشابه استدلال‌هایی برای بازهای A و G نیز هست. نکته جالب اینکه با این روش اولین نوکلئوتید سمت ‘5 رشته DNA قابل شناسایی نیست.
از معایب این روش می توان به این موارد اشاره کرد که از مواد شیمیایی خطرناک استفاده می شود، پیچیده است و نیاز به آماده سازی دارد، از آن جهت ژنوم های طولانی مثل انسان با بیش از ۵۰۰ باز نمی توان استفاده کرد و هیچ کیتی برای آن نیست.
