✍ پیروسکانس  نخستین روش توالی یابی با امکان مانیتور کردن همزمان نوکلئوتیدهایی که به رشته در حال تکثیر DNA افزوده می شوند

توالی یابی به روش سنگر، اتوماتیک و کاپیلری و ماکسام گیلبرت همگی از توالی یابی های نسل اول هستند، از مهم ترین معایب تعیین توالی به روش سنگر، استفاده از ژل الکتروفورز می باشد، در روش کاپیلری هم که توان تعیین توالی ۹۶ نمونه در یک زمان را داراست محدود به ۳۰-۶۰ kb در ۳-۴ ساعت جریان الکتروفورز است و در نهایت توالی یابی ماکسام گیلبرت نیز عاری از عیب نیست و از معایب آن می توان به استفاده از مواد شیمیایی خطرناک، پیچیده بودن مراحل آماده سازی و عدم استفاده از آن برای ژنوم های طولانی هم چون انسان اشاره کرد.

به دلایلی که گفته شد، در سال ۲۰۰۰ با پیشرفت‌های ایجاد شده در زمینه‌های نانوتکنولوژی و بیوانفورماتیک روش‌های جایگزینی به منظور افزایش سرعت و افزایش بازدهی تعیین توالی DNA ابداع شد که اصطلاحا Next Generation sequencing (NGS)  گفته می شود و نیاز به ژل الکتروفورز که فرایندی طولانی و زمان بر است نداشتند و دارای تفاوت چشمگیری با تکنیک‌های قبلی بودند، شاخص ترین ویژگی این روش ها تعیین توالی با سنتز (sequencing by synthesis) می باشد. به زبان دیگر، توانایی مانیتور کردن هم زمان نوکلئوتیدهایی که به رشته در حال تکثیر DNA افزوده می شوند وجود دارد. نخستین روش، پیروسکانس (Pyrosequencing) است که توسط P°al Nyr´en و همکارانش پی ریزی شد و برای بررسی پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی  (SNP) به کار گرفته شد. البته علیرغم تفاوت‌ها در روش سنگر و pyrosequencing اساس توالی یابی در هر دو روش سنتز رشته اسید نوکلئیک است که تکینیک‌های SBS  نامیده می‌شوند به دلیل اینکه هر دو نیاز به عمل مستقیم DNA پلیمراز برای تولید و مشاهده محصول دارند. تفاوت عمده این روش با روش‌های دیگر به کارگیری از dNTP های برچسب دار رادیواکتیو یا فلئورسنت بود. در واقع در این روش از لومینسانس برای اندازگیری سنتز پیروفسفات استفاده می شود که روند تکنیک در ادامه برایتان گفته خواهد شد. به یاد دارید که DNA پلیمراز نوکلئوتیدها (dNTP) ها را به صورت dNMP (مونوفسفاته) به رشته DNA می افزاید و یک گروه پیروفسفات را آزاد می کند. این گروه در روش پیروسکانس، به وسیله آنزیم دیگری یک واکنش نوری انجام می دهد که توسط دوربین ویژه ای میزان نور ساطع شده را اندازه می گیرند. این کار اساس روش پیروسکانس است.

مراحل این واکنش عبارت اند از:

قرار گرفتن باز درست در واکنش پیروسکانس: در این روش DNA پلیمراز با کمک dNTP و الگوی تک رشته به سنتز DNA می پردازد، اما به جای استفاده هم زمان از هر چهار نوع dNTP، نوکلئوتیدها را به صورت مجزا به محیط واکنش می افزایند، هنگامی که dNTP درست افزوده شود به صورت dNMP به رشته در حال سنتز ادغام می گردد و گروه پیروفسفات آزاد می شود، اما اگر dNTP  نادرست باشد به وسیله ی آنزیمی به نام آپیراز (Apyrase)  که یک آنزیم نوکلئوتیداز می باشد، حذف می گردد و هیچ نوری ساطع نمی شود.

قرار گرفتن باز درست در دومین مرحله واکنش با بررسی نور ساطع شده مانیتور می گردد؛ (PPi) پیروفسفات آزاد شده توسط آنزیم ATP سولفوریلاز به ATP تبدیل می شود. ATP در واکنش دیگری توسط آنزیم لوسیفراز که لوسیفرین را به اکسی لوسیفرین تبدیل می کند باعث ساطع شدن نور می گردد و در نهایت این سیگنال نوری توسط دوربین‌های حساس به سیگنال‌های ساطع شده موسوم به CCD به‌ صورت یک پیک ثبت و اندازه گیری می‌شود.

توالی یابی pyrosequencing در سال ۲۰۰۵  توسط شرکت Life Science  ۴۵۴ خریداری و به صورت تجاری ارائه گردید که این تکنولوژی قادر به توالی‌ یابی بیش از یک میلیون از قطعات DNA در یک ران می باشد.

در مرحله اول این تکنیک DNA به قطعات ۳۰۰ تا ۵۰۰ جفت بازی شکسته شده و سپس به صورت تک رشته  قبل از دناتوراسیون ،با استفاده از آداپتور به مهره های فلزی متصل می‌شود.

هر آداپتور دو نقش مهم را ایفا می کند:

۱) اولین نقش آداپتورها اتصال قطعات DNA تک رشته‌ای به بیدهای فلزی کوچک می باشد در واقع آداپتورها در انتهای ‘۵ خود دارای یک گروه بیوتین می باشد و دانه های فلزی با استرپتو آویدین پوشیده شده اند که اتصال به خاطر تمایل بالای استرپتوآویدین به بیوتین انجام می‌گیرد. سپس هر مهره فلزی (بید) در یک قطره آب در امولسیون روغن قرار می‌گیرد که به این فضا اصطلاحا میکرورآکتور می گویند و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز آب در امولسیون روغن (emPCR) جهت تکثیر DNA تک رشته انجام می‌ گیرد.

۲) نقش دیگر آداپتورها این است که به عنوان جایگاهی برای اتصال پرایمرها و در نتیجه تکثير قطعه مورد نظر، عمل می کنند. به منظور توالی یابی DNA تک رشته مورد نیاز است بنابراین دناتوراسیون محصولات PCR پس از تکثیر ضروری است. هدف از مرحله تکثیر ، افزایش تعداد قطعه هدف جهت تقویت سیگنال دریافتی و شناسایی بهتر توسط detector در مرحله تعیین توالی می باشد .

در مرحله نهایی امولسیون شکسته می‌شود و محتویات درون آن به چاهک‌های پیکولیتری در سطح یک پلیت انتقال داده می شود. شرایط به گونه ای انتخاب می شود که داخل هر چاهک فقط یک مهره فلزی می تواند قرار گیرد. سپس آنزیم‌های مورد نیاز شامل سولفوریلاز، لوسیفراز و آپیراز به همراه سایر مواد مورد نیاز برای تکثیر به هر چاهک به منظور انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، اضافه می‌شود. به این ترتیب پایروسکوئنسینگ در هر چاهک  به صورت مستقل انجام می‌گیرد.

 روش سنگر (sanger) – نسل اول تعیین توالی DNA

تعیین توالی سنگر به روش اتومات

 تکنیک توالی یابی ماکسام گیلبرت – روش تجزیه شیمیایی یا شکست زنجیر

تکنولوژی تعیین توالی ایلومینا (Illumina)