توالی یابی به روش پایروسیکوئنسینگ(Pyrosequencing)

پایروسیکوئنسینگ نخستین روش توالی یابی بر اساس سنتز با امکان مانیتور کردن همزمان نوکلئوتیدهایی که به رشته در حال تکثیر DNA افزوده می شوند

توالی یابی به روش های سنگر، اتومات و کاپیلری و ماکسام گیلبرت همگی از توالی یابی های نسل اول هستند، از مهم ترین معایب تعیین توالی به روش سنگر، استفاده از ژل الکتروفورز می باشد، در روش کاپیلری هم که توان تعیین توالی 96 نمونه در یک زمان را داراست محدود به 30-60 kb در 3-4 ساعت جریان الکتروفورز است و در نهایت توالی یابی ماکسام گیلبرت نیز عاری از عیب نیست و از معایب آن می توان به استفاده از مواد شیمیایی خطرناک، پیچیده بودن مراحل آماده سازی و عدم استفاده از آن برای ژنوم های طولانی هم چون انسان اشاره کرد.

به دلایلی که گفته شد، در سال 2000 با پیشرفت‌های ایجاد شده در زمینه‌های نانوتکنولوژی و بیوانفورماتیک روش‌های جایگزینی به منظور افزایش سرعت و افزایش بازدهی تعیین توالی DNA ابداع شد که اصطلاحا توالی یابی نسل جدید یا Next Generation sequencing (NGS)  گفته می شود و نیاز به ژل الکتروفورز که فرایندی طولانی و زمان بر است نداشتند و دارای تفاوت چشمگیری با تکنیک‌های قبلی بودند، شاخص ترین ویژگی این روش ها تعیین توالی با سنتز (sequencing by synthesis) می باشد.

این روش توسط مصطفی رونقی و پال نیرن در سال 1996 ابداع شد که در آن اندازه گیری پیروفسفات آزاد شده و دریافت سیگنال در حین سنتز مورد توجه است. این تکنولوژی توسط کمپانی Roche خریداری و به تولید رسید و با نام تجاری Roche 454 Sequencing به بازار عرضه شد.

پیروسکانس برای بررسی پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی(SNP) به کار گرفته شد. البته علی رغم تفاوت‌ها در روش سنگر و پیروسکانس، اساس توالی یابی در هر دو روش سنتز رشته اسید نوکلئیک است که تکنیک‌ SBS نامیده می‌شوند به دلیل اینکه هر دو نیاز به عمل مستقیم DNA پلیمراز برای تولید و مشاهده محصول دارند. تفاوت عمده این روش با روش‌های دیگر به کارگیری از dNTP های برچسب دار رادیواکتیو یا فلئورسنت بود. در واقع در این روش از لومینسانس برای اندازگیری سنتز پیروفسفات استفاده می شود.

به یاد دارید که DNA پلیمراز نوکلئوتیدها (dNTP) ها را به صورت dNMP (مونوفسفاته) به رشته DNA می افزاید و یک گروه پیروفسفات را آزاد می کند. این گروه در روش پیروسکانس، به وسیله آنزیم دیگری یک واکنش نوری انجام می دهد که توسط دوربین مخصوصی، میزان نور ساطع شده را اندازه می گیرند.

قرار گرفتن باز درست در واکنش پیروسکانس؛ در این روش DNA پلیمراز با کمک dNTP و الگوی تک رشته به سنتز DNA می پردازد، اما به جای استفاده هم زمان از هر چهار نوع dNTP، نوکلئوتیدها را به صورت مجزا به محیط واکنش می افزایند، هنگامی که dNTP درست افزوده شود به صورت dNMP به رشته در حال سنتز ادغام می گردد و گروه پیروفسفات آزاد می شود، اما اگر dNTP  نادرست باشد به وسیله ی آنزیمی به نام آپیراز (Apyrase)  که یک آنزیم نوکلئوتیداز می باشد، حذف می گردد و هیچ نوری ساطع نمی شود.

قرار گرفتن باز درست در دومین مرحله واکنش با بررسی نور ساطع شده مانیتور می گردد؛ (PPi) پیروفسفات آزاد شده توسط آنزیم ATP سولفوریلاز به ATP تبدیل می شود. ATP در واکنش دیگری توسط آنزیم لوسیفراز که لوسیفرین را به اکسی لوسیفرین تبدیل می کند باعث ساطع شدن نور می گردد و در نهایت این سیگنال نوری توسط دوربین‌های حساس به سیگنال‌های ساطع شده موسوم به CCD به‌ صورت یک پیک ثبت و اندازه گیری می‌شود. در مرحله اول این تکنیک DNA به قطعات 300 تا 500 جفت بازی شکسته شده و سپس به صورت تک رشته  قبل از دناتوراسیون ،با استفاده از آداپتور به مهره های فلزی متصل می‌شود.

هر آداپتور دو نقش مهم را ایفا می کند:

1- اولین نقش آداپتورها اتصال قطعات DNA تک رشته‌ای به بیدهای فلزی کوچک می باشد در واقع آداپتورها در انتهای ‘5 خود دارای یک گروه بیوتین می باشد و دانه های فلزی با استرپتو آویدین پوشیده شده اند که اتصال به خاطر تمایل بالای استرپتوآویدین به بیوتین انجام می‌گیرد. سپس هر مهره فلزی (بید) در یک قطره آب در امولسیون روغن قرار می‌گیرد که به این فضا اصطلاحا میکرورآکتور می گویند و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز آب در امولسیون روغن (emPCR) جهت تکثیر DNA تک رشته انجام می‌ گیرد.

2- نقش دیگر آداپتورها این است که به عنوان جایگاهی برای اتصال پرایمرها و در نتیجه تکثير قطعه مورد نظر، عمل می کنند. به منظور توالی یابی DNA تک رشته مورد نیاز است بنابراین دناتوراسیون محصولات PCR پس از تکثیر ضروری است. هدف از مرحله تکثیر ، افزایش تعداد قطعه هدف جهت تقویت سیگنال دریافتی و شناسایی بهتر توسط detector در مرحله تعیین توالی می باشد .

در مرحله نهایی امولسیون شکسته می‌شود و محتویات درون آن به چاهک‌های پیکولیتری در سطح یک پلیت انتقال داده می شود. شرایط به گونه ای انتخاب می شود که داخل هر چاهک فقط یک مهره فلزی می تواند قرار گیرد. سپس آنزیم‌های مورد نیاز شامل سولفوریلاز، لوسیفراز و آپیراز به همراه سایر مواد مورد نیاز برای تکثیر به هر چاهک به منظور انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، اضافه می‌شود. به این ترتیب پایروسکوئنسینگ در هر چاهک  به صورت مستقل انجام می‌گیرد.

• ویدیو آموزشی تعیین توالی DNA به روش Pyrosequencing به همراه زیرنویس اختصاصی داروینو

تفاوت های روش توالی یابی سنگر و پایروسیکوئنسینگ

تفاوت اصلی بین توالی یابی سنگر و پایروسیکوئنسینگ این است که توالی یابی سنگر یک رویکرد توالی یابی DNA است که از روش پایان دادن به زنجیره دی اکسی استفاده می کند، در حالی که پایروسیکوئنسینگ یک رویکرد توالی یابی DNA بر اساس اصل توالی یابی به سنتز است و نسل دوم توالی یابی محسوب می شود. در توالی یابی سنگر، شناسایی نوکلئوتیدها با الکتروفورز کاپیلاری پس از تکثیر قطعه DNA کامل است در حالی که در پایروسیکوئنسینگ، شناسایی نوکلئوتیدها با آزادسازی پیروفسفات در حین سنتز انجام می شود. تشخیص در توالی یابی سنگر با نور فلورسنت است، در حالی که پیروسکانس تشخیص نور مرئی در محدوده 560 نانومتر است.

علاوه بر این، پیروسکانس یک تکنیک بسیار کاربردی با دقت بالا، پردازش موازی(parallel processing) و به راحتی خودکار است. همچنین از استفاده از پرایمرهای نشاندار، نوکلئوتیدهای نشاندار و ژل الکتروفورز جلوگیری می کند. این روش هم برای توالی یابی تاییدی و هم برای توالی یابی de novo مناسب است. ویژگی مهم اصلی آن نیز عمق توالی آن است که امکان تشخیص واریانت ها با حساسیت بالا نسبت به توالی یابی سنگر را فراهم می کند.

اشکال اصلی این تکنیک مناسب بودن آن برای تعداد قطعات کم است. روش سنگر می تواند 800-1000 جفت باز را بخواند در حالی که پایروسیکوئنسینگ می تواند  300-500 جفت باز را بخواند.

بیشتر بخوانید:

• مروری بر انواع روش های توالی یابی و کاربرد آنها