آشنایی با اپی ژنتیک و روش های تشخیص متیلاسیون DNA
اپی ژنتیک
از تغییرات مهم اپی ژنتیکی می توان متیلاسیون DNA را نام برد که در سلول های یوکاریوتی اتفاق می افتد، که نقش به سزایی در تنظیم بیان ژن و محافظت از یکپارچگی DNA دارد. در حین متیلاسیون DNA یک گروه متیل توسط آنزیم DNA متیل ترانسفراز (DNMT)، بعد از همانندسازی به کربن شماره 5 حلقه پریمیدین سیتوزین اضافه می شود و در نهایت 5- متیل سیتوزین تولید می شود. متیلاسیون DNA فقط در بازهای سیتوزینی که در سمت ‘5 گوانوزین قرار دارند و به آن ها دی نوکلئوتیدهای CpG گفته می شود اتفاق می افتد ولی متیلاسیون DNA از جفت شدن باز ها جلوگیری نمی کند زیرا گروه متیل خارج از مارپیچ دو رشته ای است.
اگر در پروموتر متیلاسیون رخ دهد، باعث تغییر در اتصال فاکتورهای رونویسی و سایر پروتئین ها به DNA می شود و در نهایت پروتئین های methyl CpG binding (MeCpG) و هیستون دِاستیلازها وارد عمل می شوند و باعث فشرده شدن کروماتین در اطراف محل شروع رونویسی ژن می شوند.
در ژنوم انسان فقط نواحی بسیار کوچکی که جزایر CpG نام دارند و در نواحی پروموتری بسیاری از ژن ها یافت می شوند، دارای دی نوکلئوتیدهای CpG هستند که این موضوع به دلیل از بین رفتن آن ها طی تکامل است که به تمایل متیل سیتوزین ها به طور خود به خودی به تیمین ها مربوط است. این جزایر در ناحیه پروموتر چه در شرایط فعال چه غیر فعال بسیار در برابر متیلاسیون محافظت شده اند، ولی گاهی دچار متیلاسیون می شوند و این موضوع باعث خاموشی ژن می شود که مثال آن را دو کروموزوم های X غیر فعال می توان دید.
متیلاسیون سیتوزین ها در DNA ژنومی نقش به سزایی در تنظیم بیان ژن ها دارد و در مطالعات سرطان نیز بسیار حائز اهمیت است که سه مکانیزم مرتبط آن سرطان خاموش کردن ژن های سرکوب کننده تومور در هایپر متیلاسیون نواحی پروموتر، هایپومتیلاسیون پروتوانکوژن ها که باعث عدم توانایی مهار آن ها و در نهایت هایپومتیلاسیون کل ژنوم (نئوپلازی) که باعث افزایش نرخ جهش و ناپایداری کروموزوم می شود، می باشد.
- ویدئو آموزشی مروری مختصر بر تنظیم اپی ژنتیکی
روش های تشخیص متیلاسیون DNA
تا مدت ها بررسی متیلاسیون ها از طریق اندونوکلئازهای اختصاصی متیلاسیون و هیبریداسیون ساترن انجام می گرفت. در حال حاضر تشخیص متیلاسیون در کل ژنوم از طریق تکنیک های جداسازی با کارایی بالا و روش های آنزیمی و مکانیکی انجام می گیرد. روش های دسته دوم نسبت به دسته اول حساسیت کمتری دارند اما مقرون به صرفه ترند و به همین علت همواره مورد استفاده قرار می گیرند.
اساس این روش ها عدم توانایی آنزیم های محدودکننده حساس به متیلاسیون در بریدن سیتوزین های متیله شده در جایگاه تشخیص است. DNA ژنومی به وسیله اندونوکلئازهای حساس به برش بریده و در ژل آگارز به پروب های اختصاصی متصل می شود در حالی که در توالی های بریده شده برشی صورت نمی گیرد در نتیجه، در الکتروفورز نوارهایی با طول بیشتر دیده می شود.
تجزیه و تحلیل متیلاسیون در سطح ژنوم
- توالی یابی بی سولفیت کل ژنوم / Whole-genome bisulfite sequencing (WGBS)
تکنیکهای توالییابی نسل بعدی(NGS) را برای نمونههای ورودی تبدیلشده به بی سولفیت اعمال میکند. همچنین WGBS نقشه های متیلاسیون DNA کل ژنوم میکروارگانیسم را با وضوح تولید می کند.
- توالی یابی بی سولفیت با محدودیت / (Reduced representation bisulfite sequencing (RRBS
بی سولفیت و پوشش توالی یابی در مقیاس ژنومی با توان عملیاتی بالا را با استفاده از آنزیم های محدود کننده حساس به متیلاسیون برای غنی سازی نمونه ها برای محتوای غنی از CpG ترکیب می کند. به طور موثر توالی یابی را فقط به مناطقی از DNA که متیلاسیون رخ داده است، محدود می کند.
تجزیه و تحلیل هدفمند متیلاسیون
پرایمرهای PCR را برای الگوهای DNA تبدیل شده به بی سولفیت که متیله یا غیر متیله هستند، اعمال می کند. PCR اختصاصی تفاوت ها را نشان می دهد که آیا تغییرات متیلاسیون DNA وجود دارد یا خیر.
یکی از روشهای توالی یابی بر پایه سنتز است که می تواند DNA تبدیل شده به بی سولفیت را در یک منطقه خاص مورد بررسی قرار دهد. سطح 5mC با مقایسه نسبت باز های C و T در یک مکان جداگانه تعیین می شود.
- تجزیه و تحلیل ذوب با وضوح بالا (HRM)
در ابتدا برای تشخیص SNP مورد استفاده قرار می گرفت اما این فرآیند برای متیلاسیون DNA نیز پذیرفته شده است. پروتکل زمان واقعی مبتنی بر PCR دمای ذوب آمپلیکون های PCR را اندازه گیری می کند. تغییر در دمای ذوب، که بر اساس محتوای C-T متفاوت است، با سطح متیلاسیون DNA در نمونه مطابقت دارد.
- روش رسوب ایمنی DNA یا DIP(DNA immunoprecipitation)
روش دیگری که معمولاً برای ترسیم مکان های دارای متیلاسیون DNA استفاده می شود DIP است. DIP به شدت به داشتن آنتی بادی هایی وابسته است که قادر به تشخیص تغییرات DNA مورد نظر هستند. همچنین در مقایسه با توالی یابی WGBS که به تعیین توالی کل ژنوم نیاز دارد، بسیار ارزان تر و آسان تر است. DIP فقط به تعیین توالی نواحی برش داده شده DNA کوچک در مرحله IP شما نیاز دارد.
این روش، مشابه روش ChIP است، اما ماده اولیه شما DNA ژنومی خام و بدون نیاز به کروماتین است. این DNA ژنومی تقریباً 150 تا 300 جفت باز برش میدهد و سپس این DNA برششده میتواند تحت دناتوراسیون قرار گیرد. این مرحله ضروری است زیرا آنتی بادی تنها قادر به دسترسی به تغییرات درون DNA دناتوره(باز شده) هستند. یک شب انکوبه میشوند و پس از آن نمونهها تحت یک مرحله IP قرار میگیرند تا تمام DNA متصل به آنتیبادی را جدا کنند. استفاده از مگنتیک بید برای این مرحله IP توصیه می شود.
با هدف قرار دادن آغازگرهای خاص بی سولفیت به دنباله ای که بلافاصله قبل از یک CpG است، یک CpG مورد نظر را جستجو می کند. دیاکسی نوکلئوتیدهای پایاندهنده DNA پلیمراز به پرایمر اجازه میدهند تا یک باز واحد را گسترش دهد، که سپس میتوان آن را به صورت کمی برای تعیین محتوای C-T اندازهگیری کرد و وضعیت متیلاسیون DNA آن را تعیین کرد.
برای یادگیری تکنیک متیلاسیون DNA و سایر تکنیک های مورد نیاز برای آزمایشگاه ژنتیک مولکولی
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.
معایب تکنیک های متیلاسیون DNA
فقط سیتوزین هایی قابل بررسی می باشند که به وسیله اندونوکلئازهای اختصاصی متیلاسیون موجود، قابل تشخیص باشند.
این روش ها بیشتر برای آنالیزهای متیلاسیونی کل ژنوم مناسب می باشد ولی در بررسی وضعیت متیلاسیون جایگاه های CpG اختصاصی خیلی مفید نیستند.
این تکنیک ها اگر چه ساده و سریع و دارای حساسیت بالایی هستند ولی به مقدار زیادی DNA با کیفیت نیاز دارند که باید با روش PCR این مشکل را رفع کرد، اما در صورت بهره گیری از PCR، تجزیه مولکول های DNA با اندونوکلئازهای حساس به متیلاسیون باید قبل از تکثیر به وسیله PCR صورت گیرد، به این دلیل که متیلاسیون سیتوزین نباید بعد از PCR حفظ شود و 5-متیل سیتوزین به سیتوزین تبدیل شود.
پرایمرها هم باید به گونه ای طراحی شوند که، اختصاصی نواحی بالادست و پایین دست جایگاه تشخیص اندونوکلئاز حساس به متیلاسیون باشند. سپس DNA شکسته شده تحت تاثیر آنزیم، توسط پرایمرها تکثیر میشود. در صورت متیله بودن جایگاه تشخیص، DNA الگو بریده نمی شود و محصول PCR خواهیم داشت. در حالی که اگر جایگاه تشخیص غیرمتیله باشد، از آنجایی که توالی الگو به قطعاتی تقسیم میشود، محصولی ایجاد نخواهد شد. حتی اگر DNA الگو در جایگاه تشخیص خود کاملا غیرمتیله باشد، به علت حساسیت بالای PCR، وجود نقص در برش در مقادیر اندک نیز می تواند منجر به نتایج مثبت کاذب شود. پس تفسیر نتایج این تکنیک باید با احتیاط زیاد انجام گیرد.
بررسی متیلاسیون در بافت به طور اختصاصی از طریق روش های وابسته به هیبریداسیون in situ و با بهره گیری از آنتی بادی های آنتی-متیل سیتوزین لیبل شده صورت می گیرد. هیبریداسیون in situ از تکنیک های به روز دیگر Microarray های اختصاصی متیلاسیون می باشد که به وسیله آن می توان بررسی متیلاسیون چند ژن مختلف در یک آزمایش را بررسی کرد.
برای دریافت خدمات مربوط تکنیک متیلاسیون DNA و انجام انواع تست های ژنتیک مولکولی
از طریق لینک خدمات آزمایشگاهی می توانید اقدام نمایید
بیشتر بخوانید:
