تکنیک Digital PCR یا dPCR یک روش دقیق با حساسیت بالا جهت تعیین میزان DNA و RNA موجود در نمونه ها
در تکنیک Digital PCR یا (dPCR) از نظر مواد اولیه و مرحله تکثیر اسید نوکلئیک ها مشابه qPCR یا همان Real Time PCR می باشد، یعنی از شیوه های تشخیصی بر مبنای پروب های فلوئورسنت و روش تکثیر PCR استاندارد استفاده می شود و تنها تفاوت در این است که، در این روش میزان قطعی نوکلئیک اسیدهای نمونه مورد نظر، بدون نیاز به منحنی استاندارد و رفرنس ها به دست می آید.
در تکنیک qPCR سیگنال های آزاد شده از توالی های نادر مثل جهش های نقطه ای از سیگنال های آزاد شده از توالی طبیعی قابل تشخیص نیست چون توسط آن ها پوشانده می شود اما حساسیت در روش dPCR به گونه ای است که توالی های نادر هم در میان حجم زیادی از توالی طبیعی می توان تشخیص داد.
تاریخچه تکنیک Digital PCR یا dPCR
تکنیک Digital PCR نخستین بار در سال 1992 توسط skyes و همکارانش معرفی شد، آن ها با انجام یک آزمایش PCR دو مرحله ای ژن جهش یافته زنجیره سنگین ایمونوگلوبولین در یک کلون لوسمیک را از بین تعداد زیادی لنفوسیت طبیعی تشخیص دادند که تعیین این میزان دقیق با استفاده از رقت سازی محدود (limiting dilution) و توزیع پواسون انجام گرفت. سپس در سال 1997، kalinina و همکارانش تنها یک توالی DNA در میان کل ژنوم با استفاده از PCR ساده شناسایی کردند که این روش در مقیاس نانولیتر با استفاده از پروب های TaqMan و لوله های مویین انجام شد.
در سال 1999، Vogelstein و Kinzler با روش های قبلی نسخه جدیدی از تکنیک Digital PCR را با پلیتی با 96 چاهک ارائه دادند و واژه Digital PCR را برای اولین بار به کار بردند. این پژوهشگران نمونه های بیماران سرطان کولورکتال مورد بررسی را به قدری رقیق کردند که در هر دو چاهک تنها یک نمونه الگو قرار بگیرد و سپس با پروب های فلوئورسنت لیبل شده شناسایی آلل های جهش یافته صورت گرفت. اما این سیستم ها بسیار دشوار بودند و بررسی حجم زیادی از نمونه با آن ها میسر نبود و مدت زمان زیادی لازم داشتند، بنابراین برای انجام آنالیز های پیچیده، Emulsion PCR، چیپ های Microfluid(تکنیک droplet digital PCR) و Microarray ها توسعه یافتند.
پروتکل انجام تکنیک Digital PCR
در روش تعیین غلظت سلول های باکتری، کشت باکتری به صورت پیدرپی رقیق و مقداری از مخلوط رقیق شده در محیط رشد آگار کشت داده می شود. پس از انکوباسیون و تشکیل کلونی، کلونی ها شمرده شده و تعداد آن ها به dilution factor تقسیم می گردد. در این حالت فرض می شود که به علت رقیق بودن مخلوط اولیه هر کلونی باکتریایی از یک سلول باکتری به وجود آمده است.
در تکنیک dPCR نمونه DNA مورد نظر به طور پی در پی رقیق می شود و پس از آن بین تعداد زیادی از چاهک های واکنش که حاوی مواد اولیه مشابه مواد اولیه واکنش در Real Time PCR هم چون پرایمر ها، پروب های فلوئورسنت و…هستند تقسیم بندی می گردد.
سپس واکنش PCR متداول با دستگاه ترمال سایکلر انجام می گیرد و در نهایت واکنش هایی که سیگنال فلوئورسنت دارند مثبت گفته می شوند و با شماره 1 نشان داده می شوند و واکنش هایی که فقط سیگنال پیش زمینه را دارند با 0 شماره گذاری می شوند و با استفاده از فرمولی به نام توزیع پواسن غلظت مولکول های هدف به طور دقیق معین می شوند.
اگر یک آزمایش تصادفی به شکلی باشد که وقوع یک پیشامد، مرتبط با واحد مکان یا زمان باشد، یک آزمایش توزیع پواسون نامیده می شود. توزیع پواسون احتمال وجود چاهک با هر تعداد مولکول DNA را در صفحه محاسبه میکند.
امروز دستگاه های زیادی جهت Digital PCR توسط کمپانی های مختلف به بازار عرضه می شوند اما اساس کار همه آن ها یکی است. یکی از معروفترین دستگاه ها Thermo Fisher scientific’s QuantStudio 12k Flex می باشد.
دستگاه Thermo Fisher scientific’s QuantStudio 12k Flex
تکنیک Droplet Digital PCR نیز یک نوع dPCR می باشد که برای دسترسی به دقت بسیار بالا، درون هزاران قطره با اندازه نانولیتر انجام می شود و نمونه مورد نظر در حدی رقیق می شود که درون هر قطره یا هیچ یا یک مولکول DNA قرار بگیرد سپس مواد مورد نیاز واکنش مثل پروب های TaqMan تشخیصی جهت آلل های مختلف مورد بررسی و سایر واکنشگر های لازم اضافه می شوند.
پس از PCR میزان فلورسانس در هر قطره اندازه گیری می شود و در نهایت هم تعداد قطره ها جهت تشخیص سیگنال های مربوط به آلل های طبیعی و جهش یافته شمارش می شود. و از مزایای این تکنیک این هست که به دلیل حساسیت و دقت بسیار بالایی که دارد جهش های بسیار نادر هم چون حالت موزائیک یا جهش های سوماتیک اکتسابی یا جهش های پدری در حالت بررسی جهش های وراثتی در DNAجنینی آزاد در خون مادر، به وجود بیاورد.
بیشترین کاربرد Digital PCR تاکنون
بیشترین کاربرد تکنیک Digital PCR در میکروبیولوژی بوده است. هم تشخیص پاتوژن و هم تشخیص میکروبیوم، غالبا نیازمند تشخیص میزان اندک میکروارگانیسم در پس زمینه ای پیچیده از سایر سلول ها است.
کاربردهای تکنیک Digital PCR یا dPCR در این زمینه عبارتند از:
- تشخیص ویروس ها در سطحی پایین تر از سطح قابل شناسایی بوسیله تست های رایج و بررسی روند بیماری
- تشخیص میزان پاتوژن ها پیش و پس از عمل پیوند (allotransplantation)
- تشخیص و بررسی مقاومت میکروبی
- تشخیص پاتوژنها در غذاها
بیشتر بخوانید: