کاربرد و موارد استفاده از تکنیک Multiplex PCR (PCR چندتایی/مرکب)
تکنیک Multiplex PCR یک روش مولکولی گسترده به منظور تکثیر اهداف متعدد در یک آزمایش PCR است. در مطالعات چندین اگزون از یک ژن و بررسی جهش های موجود در آن ها لازم است چندین توالی اسیدهای نوکلئیک را تکثیر کنیم که برای انجام این کار از تکنیک Multiplex PCR استفاده می کنیم چرا که باعث صرفه جویی در زمان و هزینه می شود و روشی سریع و راحت در تشخیص پزشکی (به عنوان مثال تشخیص بیماری زایی دو سویه مختلف باکتریایی) و آزمایشات تحقیقاتی می باشد.
تاریخچه تکنیک Multiplex PCR
تکنیک Multiplex PCR نخستین بار در سال 1988 برای شناسایی جهش های dystrophin استفاده شد و امروزه برای شناسایی SNP ها و میکروستلیت ها در انگشت نگاری DNA بسیار پرکاربرد می باشد. استفاده از این تکنیک زمان، هزینه و خطر آلودگی متقاطع را کاهش می دهد، زیرا جابجایی نمونه حداقل است.
برای انجام این آزمایش به جای یک جفت پرایمر چندین جفت پرایمر به واکنش PCR افزوده شده که در نهایت منجر به تکثیر توالی هایی با اندازه های مختلف می شود. تعداد توالی های مورد نظرمی تواند بین 2 تا 50 باشد. در Multiplex PCR باید پرایمرها و شرایط واکنش بهینه شوند همان طور که گفته شد به دلیل استفاده از بیش از یک جفت پرایمر احتمال تشکیل هترودایمر و همودایمر بین پرایمرها افزایش پیدا می کند و درصد خطا و تشکیل محصولات غیر اختصاصی زیاد می شود.
راهکارهای مناسب جهت جلوگیری از دایمر پرایمرها
بهتر است نسبت میزان توالی الگو به میزان پرایمرها در واکنش PCR بسته به اندازه توالی الگو و میزان پیچیدگی آن تنظیم شود. در طراحی پرایمر ها باید درصد GC و همولوگ بودن آن ها با توالی الگو در نظر گرفته شود و همچنین احتمال اتصال خود به خودی پرایمرها در دماهای پایین تر از شروع سیکل حرارتی PCR می تواند منجر به تشکیل دایمرها شود که با Hot start PCR می توان مانع این امر شد.
باید سعی کرد طول پرایمرهای استفاده شده، درصد GC نسبتا یکسانی داشته باشند. افزایش اجزای PCR هم چون بافر، dNTP و MgCl2 نیز در multiplex در مقایسه با PCR عادی باعث افزایش اختصاصیت و حساسیت واکنش می شود البته باید دقت شود چرا که افزایش بیش از حد هر کدام می تواند منجر به افزایش دایمر پرایمرها و افت واکنش شود.
کاربردهای تکنیک Multiplex PCR
ژنوتایپینگ SNP
تشخیص RNA
تشخیص پاتوژن
جهش و تجزیه و تحلیل پلی مورفیسم
تشخیص GMO(ارگانیسم اصلاح شده ژنتیکی)
مطالعات پزشکی قانونی(Forensic studies)
تجزیه و تحلیل مواد غذایی
تجزیه و تحلیل حذف ژن
اندازه گیری الگو (Template quantitation)
تجزیه و تحلیل Linkage
شناسایی سویه های مختلف میکروارگانیسم ها
تشخیص عفونت های همزمان ویروسی بویژه بیماری های مقاربتی
مزایای استفاده از تکنیک Multiplex PCR
در Multiplex PCR هر کدام از قطعات آمپلیکون برای سایر قطعات تکثیر شده یک کنترل داخلی محسوب می شود در حالی که در PCR عادی مثبت کاذب در اثر آلودگی و منفی کاذب در اثر عدم انجام واکنش ممکن است اتفاق بیفتد و کیفیت DNA الگو در این نوع PCR در مقایسه با PCR عادی بهتر تعیین می شود.
در صورت مطالعه چندین ژن انجام این تکنیک نسبت به انجام چندین واکنش PCR عادی در چندین ویال راحت تر است بنابراین خطای سمپلینگ کمتر خواهد شد و دقت نرمال سازی داده های بیشتر خواهد شد. همچنین به دلیل استفاده از مواد اولیه کمتر، از لحاظ هزینه مالی و زمانی مقرون به صرفه تر است.
برای یادگیری تکنیک های مورد نیاز برای کار در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.
بیشتر بخوانید: