✍ کاربرد و موارد استفاده از تکنیک Long PCR و موارد لازم برای بهینه سازی

PCR  عادی برای تکثیر قطعاتی از DNA که طولی کمتر از ۱۰۰۰ bp دارند بسیار کارآمد است ولی وقتی این طول بیشتر شود بازده PCR پایین آمده و باید تلاش زیادی برای بهینه سازی شرایط واکنش انجام داد.

در سال ۱۹۹۴ محققی به نام Barnes فرضیه هایی را ارائه داد که به روشی قابل اطمینان برای تکثیر توالی های طولانی تبدیل شد.  اوعقیده داشت که خطای Taq DNA  پلیمراز که یک DNA  پلیمراز highly processive در جهت ‘۵ به ‘۳ می باشد و خاصیت تصحیح اگزونوکلئازی ( exonuclease proofreading) در جهت ‘۳ به ‘۵ را ندارد، باعث جفت شدن نادرست بازها و در نهایت کاهش راندمان تکثیر می شود و چنان چه این خطا در انتهای ‘۳ توالی باشد تکثیر به اتمام نمی رسد. برای رفع این مشکل می توان ازDNA  پلیمرازهای مقاوم به حرارت مثل Pwo ، Pfu و Vent که خاصیت تصحیح اگزونوکلئازی در جهت ‘۳ به ‘۵ دارند استفاده کرد. ولی فقط استفاده از این پلیمراز ها  با خاصیت اگزونوکلئازی برای تکثیر قطعات طولانی DNA به تنهایی کافی نیست که این می تواند به خاطر تجزیه بیش از اندازه ی پرایمرها در اثر فعالیت اگزونوکلئازی و میزان processivity   پایین این آنزیم ها باشد. به همین خاطر Barnes  به منظور PCR مخلوطی از هر دو نوع DNA پلیمراز یعنی یک DNA پلیمراز با Processivity  بالا مانند Taq ویک DNA پلیمراز با خاصیت تصحیح اگزونوکلئازی استفاده کرد با این روش دیگر هم اتصال نادرست بازها کاهش و بازده تکثیر قطعات در حین مرحله extension افزایش خواهد یافت.

کارهای دیگری که می توان برای بهینه سازی  Long PCR انجام داد عبارت اند از:

بهینه سازی بافر که افزایش PH باعث افزایش دقت در تکثیر در DNA  پلیمرازهای  دارای خاصیت اگزونوکلئازی می باشد.

شرایط چرخه حرارتی: افزایش سرعت چرخه حرارتی و تغییر دمای سریع تر باعث بهبود Long PCR  می شود.

از فواید Long PCR می توان به افزایش توانایی تکثیر توالی های ناشناخته و یا متغیر با طول زیاد اشاره کرد. برای مثال برای تکثیر توالی های اینترونی ناشناخته با استفاده از پرایمرهایی که به اگزون های دو طرف توالی هدف متصل می شوند، برای تکثیر ژنوم میتوکندریایی به طور کامل و یا برای توالی هایی بزرگی از DNA جهت پیدا کردن جهش های حذفی که منجر به بیماری ژنتیکی می شوند، در جهت تکثیر ژنوم بسیاری از ویروس های DNA دار در ویروس شناسی  و حتی مشخص کردن نوع و سویه باکتری در میکروبیولوژی می توان از Long PCR استفاده کرد.

با اینکه محققان خودشان این توانایی را دارند که سیستم Long PCR مورد استفاده شان را بسازند اما امروزه کیت های آماده زیادی جهت Long PCR وجود دارد که به طور عمده برای  پژوهشگران مقرون به صرفه نیز است و افزایش کیفیت انجام فرآیند و وجود کنترل های مناسب به منظور بررسی بازده فرآیند از مزایای این کیت ها به شمار می آید.