تکنیک Long PCR؛ کاربردها و نحوه بهینه سازی
PCR متداول برای تکثیر قطعاتی از DNA که طولی کمتر از bp 1000 دارند بسیار کارآمد است اما هنگامی که طول قطعه بیشتر شود(بیشتر از 5KB) بازده PCR پایین آمده و برای بهینه سازی شرایط واکنش باید تلاش زیادی انجام داد. قطعات DNA تا 20 کیلوباز را می توان با پروتکل Long PCR تکثیر کرد. تکنیک Long PCR همان PCR متداول است با این تفاوت که به جای استفاده از Taq پلیمراز از چندین DNA پلیمرازهای مقاوم به حرارت استفاده میشود.
در سال 1994 پژوهشگری به نام Barnes فرضیه هایی را ارائه داد که به روشی قابل اطمینان برای تکثیر توالی های طولانی تبدیل شد. او عقیده داشت که خطای Taq پلیمراز(DNA پلیمراز highly processive) در جهت ‘5 به ‘3 می باشد و خاصیت تصحیح اگزونوکلئازی(Exonuclease Proofreading) در جهت ‘3 به ‘5 را ندارد، باعث جفت شدن نادرست بازها و در نهایت کاهش راندمان تکثیر می شود و چنان چه این خطا در انتهای ‘3 توالی باشد تکثیر به اتمام نمی رسد.
در واقع Taq پلیمراز می تواند dNTP ها را تا 1kb تا 2kb اضافه کند، پس از آن احتمال ادغام dNTP های اشتباه افزایش می یابد. برای رفع این مشکل می توان از DNA پلیمرازهای مقاوم به حرارت مثل Pwo ،Pfu و Vent که خاصیت تصحیح اگزونوکلئازی در جهت ‘3 به ‘5 دارند استفاده کرد. اما فقط استفاده از این پلیمراز ها با خاصیت اگزونوکلئازی برای تکثیر قطعات طولانی DNA به تنهایی کافی نیست.
این می تواند به خاطر تجزیه بیش از اندازه ی پرایمرها در اثر فعالیت اگزونوکلئازی و میزان باProcessivity پایین این آنزیم ها باشد. به همین خاطر Barnes به منظور PCR مخلوطی از هر دو نوع DNA پلیمراز یعنی یک DNA پلیمراز باProcessivity بالا مانند Taq و یک DNA پلیمراز با خاصیت تصحیح اگزونوکلئازی استفاده کرد. با این روش اتصال نادرست بازها کاهش و بازده تکثیر قطعات در حین مرحله Extension افزایش خواهد یافت.
پروتکل آزمایش Long PCR
بهترین جایگزینی که میتوانیم به جای Taq پلیمراز استفاده کنیم Vent است. از ترکیب دو پلیمراز مختلف یعنی یکی با غلظت بالا(معمولاً Taq پلیمراز) و دیگری با غلظت کم(یک DNA پلیمراز با Fidelity بالا استفاده کنید). از 1 تا 1.5 واحد نرمال Taq و 0.5 تا 1 واحد DNA پلیمراز با کیفیت بالا استفاده کنید.
پرایمرهای مورد استفاده در Long PCR باید به گونه ای طراحی شوند که 22 تا 30 نوکلئوتید داشته باشند و محتوای GC آنها کمتر از 50 درصد باشد. علاوه بر این، باید ظرفیت کمی در تشکیل ساختار ثانویه داشته باشند و دمای انلینگ(اتصال) آنها بین 58 تا 68 باشد. توجه داشته باشید که برای الگوهای پیچیده DNA از پرایمرهای با غلظت کم و برای الگوهای ساده تر از پرایمرهایی با غلظت بالا استفاده کنید.
بهینه سازی آزمایش Long PCR
بهینه سازی بافر: افزایش PH بافر که علت افزایش دقت در تکثیر در DNA پلیمرازهای دارای خاصیت اگزونوکلئازی می باشد را در نظر بگیرید. برای تقویت راندمان واکنش، بافر باید مقدار بالایی از MgCl2 داشته باشد. با این حال، غلظت یون های منیزیم به هدف واکنش ما بستگی دارد زیرا غلظت بالاتر واکنش باعث افزایش اتصالات غیر اختصاصی به واکنش می شود. همچنین، ما می توانیم از KCl، Tricin، DMSO و سایر مواد شیمیایی بر اساس نیاز واکنش استفاده کنیم
شرایط چرخه حرارتی: افزایش سرعت چرخه حرارتی و تغییر دمای سریع تر، باعث بهبود Long PCR می شود.
مزایای تکنیک Long PCR
Long PCR اولین انتخاب برای تشخیص الگوهای طولانی حاوی تکرار CpG است.
از فواید تکنیک Long PCR می توان به افزایش توانایی تکثیر توالی های ناشناخته و یا متغیر با طول زیاد اشاره کرد(توالی های بزرگی که با PCR متداول به خوبی تکثیر نمی شوند).
تکثیر توالی هایی بزرگ DNA برخی از بیماری های ژنتکی همانند سندرم X شکننده جهت پیدا کردن جهش های حذفی که منجر به بیماری می شوند.
تکثیر توالی های اینترونی ناشناخته با استفاده از پرایمرهایی که به اگزون های دو طرف توالی هدف متصل می شوند.
انجام ژنوتایپینگ
انگشت نگاری DNA
تکثیر ژنوم بسیاری از ویروس های DNA دار در ویروس شناسی. همچنین از RT-Long PCR برای بررسی بیان ژن های مربوط به ویروس های RNAدار استفاده می شود
تکثیر ژنوم میتوکندریایی
مشخص کردن نوع و سویه باکتری ها
با اینکه محققان خودشان این توانایی را دارند که سیستم Long PCR مورد استفاده شان را بسازند اما امروزه کیت های آماده زیادی جهت Long PCR وجود دارد که به طور عمده برای پژوهشگران مقرون به صرفه است و افزایش کیفیت انجام فرآیند و وجود کنترل های مناسب به منظور بررسی بازده فرآیند از مزایای این کیت ها به شمار می آید.
بیشتر بخوانید: