استخراج DNA با پروتئیناز K

روش استخراج DNA با استفاده از آنزیم پروتئیناز- K

استخراج DNA با پروتئیناز K به دلیل نقش مهم آنزیم پروتئیناز K در استخراج DNA به عنوان یک روش آنزیمی استخراج DNA نیز محسوب می شود. پروتئیناز- K یکی از رایج ترین آنزیم های مورد استفاده در زیست شناسی مولکولی و انتخابی عالی برای هضم پروتئین در کاربردهای مختلف است که پروتئینهای هیستونی و غیر هیستونی در DNA را تخریب می کند . این آنزیم در دمای 55 درجه سانتی گراد بهترین فعالیت را دارا می باشد.

تاریخچه کشف DNA چیست؟

DNA یا اسید دئوکسی ریبونوکلئیک ماده وراثتی در انسان و تقریباً همه موجودات دیگر است. تقریباً هر سلول در بدن افراد دارای DNA یکسان است. بیشتر DNA در هسته سلول قرار دارد (جایی که DNA هسته ای نامیده می شود)، اما مقدار کمی از DNA را می توان در میتوکندری نیز یافت (جایی که به آن DNA میتوکندری یا mtDNA می گویند).

اطلاعات موجود در DNA به صورت کد در بازهای آلی ذخیره می شود: آدنین (A)، گوانین (G)، سیتوزین (C) و تیمین (. (T DNA انسان از حدود 3 میلیارد باز تشکیل شده است و بیش از 99 درصد از این پایگاه ها در همه افراد یکسان است. ترتیب یا توالی این پایه ها اطلاعات موجود برای ساختن و نگهداری یک موجود زنده را مشخص می کند، مشابه روشی که حروف الفبا به ترتیب خاصی برای تشکیل کلمات و جملات ظاهر می شوند.

یکی از ویژگی های مهم DNA  همانند سازی است. هر رشته از DNA در مارپیچ دورشته ای می تواند به عنوان الگویی برای تکثیر توالی بازها عمل کند. این امر هنگام تقسیم سلولی بسیار مهم است زیرا هر سلول جدید نیاز به یک کپی دقیق از DNA موجود در سلول قدیمی دارد.

بسیاری از مردم معتقدند که جیمز واتسون زیست شناس آمریکایی و فرانسیس کریک فیزیکدان انگلیسی در دهه 1950 DNA را کشف کردند. در واقع اینطور نیست.  DNA اولین بار در اواخر دهه 1860 توسط شیمیدان سوئیسی فردریش میشر شناسایی شد.

در سال 1869، فردریش میشر از لکوسیت‌هایی که از نمونه‌ها روی باندهای جراحی تازه جمع‌آوری کرده بود استفاده کرد و آزمایش‌هایی را برای خالص‌سازی و طبقه‌بندی پروتئین‌های موجود در این سلول‌ها انجام داد.

میشر در طی آزمایشات خود ماده جدیدی را در هسته‌ ها شناسایی کرد. سپس دو پروتکل برای جدا کردن هسته سلول‌ها از سیتوپلاسم و جداسازی این ترکیب جدید، که امروزه به نام DNA شناخته می‌شود، ایجاد کرد، که با پروتئین‌ها و سایر مواد متفاوت است.

سپس، در دهه‌های پس از کشف میشر، دانشمندان دیگر – به ویژه فیبوس لوین و اروین شارگاف – مجموعه‌ای از تلاش‌های تحقیقاتی را انجام دادند.  بدون پایه علمی ارائه شده توسط این پیشگامان، واتسون و کریک ممکن بود هرگز به نتیجه پیشگامانه خود در سال 1953 نرسیده بودند: اینکه مولکول DNA به شکل یک مارپیچ دو بعدی سه بعدی وجود دارد.

استخراج DNA نیز یکی از مدرن ترین تکنیک های علوم زیستی و پزشکی است. فرایندی است که طی آن DNA به واسطه  روش‌های فیزیکی و شیمیایی از نمونه مورد نظر جداسازی می‌شود. دانشمندان و پزشکان از استخراج DNA برای تشخیص بسیاری از بیماری ها، در مهندسی ژنتیک گیاهان و حیوانات استفاده می کنند. استخراج DNA همچنین می تواند برای جمع آوری شواهد در تحقیقات جرم نیز استفاده قرار گیرد.

آنزیم پروتئیناز K

آنزیم پروتئیناز K (همچنین به عنوان اندوپپتیداز K یا پروتئاز K شناخته می شود) یک آندوپپتیداز سرین وابسته به تتیلیسین است که انواع پیوندهای پپتیدی را هیدرولیز می کند. این آنزیم در ابتدا پیوند پپتیدی مجاور گروه کربوکسیل اسیدهای آمینه آلیفاتیک و معطر را با گروه های آمینو آلفا مسدود شده را هیدرولیز می کند. پروتئیناز K در شرایط متفاوتی از دما و بافر با فعالیت مطلوب بین 20 تا 60 درجه سانتیگراد و pH بین 7.5 و 12.0 فعال است.

آنزیم پروتئیناز K در سال 1974 در عصاره های آلبوم قارچ Engyodontium کشف شد.  پروتئیناز K همچنین قادر به هضم کراتین است، به همین دلیل، “پروتئیناز K” نامیده می شود. محل غالب برش آنزیم پروتئیناز K ، پیوند پپتیدی مجاور گروه کربوکسیل اسیدهای آمینه آلیفاتیک و آروماتیک با گروه های آلفا آمینه مسدود شده است. معمولاً به دلیل ویژگی گسترده آن استفاده می شود. این آنزیم متعلق به خانواده پپتیداز (S8 subtilisin) است. وزن مولکولی پروتئیناز K (کا) 28900 دالتون است.

فعالیت آنزیم پروتئیناز K نسبت به پروتئین های بومی توسط مواد دناتوره کننده مانند SDS تحریک می شود. در مقابل، هنگامی که با استفاده از سوبستراهای پپتیدی اندازه گیری می شود، دناتوره کننده ها آنزیم (مانند DNase و RNase )را بدون مراجعه به یک فرآیند دناتوراسیون را مهار می کند. دلیل این نتیجه این است که عوامل دناتوره کننده، بسترهای پروتئینی را باز می کنند و آنها را برای پروتئاز در دسترس تر قرار می دهند.

فعالیت آنزیمی پروتئیناز K

این آنزیم که توسط کلسیم فعال می شود، پروتئین ها را ترجیحاً پس از اسیدهای آمینه آبگریز (آلیفاتیک، معطر و سایر اسیدهای آمینه آبگریز) هضم می کند. اگرچه یون‌های کلسیم بر فعالیت آنزیم تأثیر نمی‌گذارند، اما به پایداری آن کمک می‌کنند. اگر زمان انکوباسیون طولانی باشد و غلظت پروتئاز به اندازه کافی بالا باشد، پروتئین ها کاملاً هضم می شوند.

با حذف یون های کلسیم، پایداری آنزیم کاهش می یابد، اما فعالیت پروتئولیتیک باقی می ماند. پروتئیناز K دارای دو محل اتصال برای Ca2+ است که نزدیک به مرکز فعال قرار دارند، اما مستقیماً در مکانیسم کاتالیزوری دخالت ندارند. فعالیت باقیمانده برای هضم پروتئین ها کافی است که معمولاً آماده سازی اسید نوکلئیک را آلوده می کند. بنابراین، هضم با پروتئیناز K برای خالص سازی اسیدهای نوکلئیک معمولاً در حضور EDTA (مهار آنزیم های وابسته به یون فلز مانند نوکلئازها) انجام می شود.

کاربردهای پروتئیناز K

پروتئیناز K به طور گسترده در زیست شناسی مولکولی برای هضم پروتئین ها و حذف ناخالصی ها ازبین بردن آلودگی در  آماده سازی اسید نوکلئیک استفاده می شود. با افزودن پروتئيناز K به فرآورده هاي اسيد نوكلئيك، نوكلئازهايي كه ممكن است در حين خالص سازي DNA يا RNA را تجزيه كنند، به سرعت غيرفعال مي شوند.

برای این کاربرد مناسب است زیرا آنزیم در حضورمواد شیمیایی دناتوره کننده پروتئین مانند SDS و اوره، عوامل شل کننده مانند EDTA، معرف های سولفید هیدروژن و مهارکننده های تریپسین یا کیموتریپسین فعال است. پروتئیناز K برای تخریب پروتئین در لیز سلول ها(بافت ها، سلول های کشت سلولی) و برای آزادسازی اسید نوکلئیک استفاده می شود، زیرا DNases و RNases را با کارایی بالا غیرفعال می کند. به عنوان مثال: پروتئیناز K در خالص سازی DNA یا RNA بسیار طبیعی و سالم بسیار مفید است، زیرا اکثر DNaseها و RNaseهای میکروبی یا پستانداران به سرعت توسط آنزیم غیرفعال می شوند، به ویژه در حضور 0.5-1٪ SDS.

فعالیت آنزیم به سمت پروتئین های بومی توسط مواد دناتوره کننده مانند SDS تحریک می شود. در مقابل، هنگام اندازه‌گیری با سوبستراهای پپتیدی، دناتوره ‌کننده‌ها آنزیم را مهار می‌کنند. دلیل این بررسی این است که دناتوره‌کننده‌ها، لایه های پروتئینی را باز کرده و آنها را برای پروتئاز در دسترس‌تر می‌کنند.

مهارکننده های پروتئیناز K دارای دو پیوند دی سولفیدی است، اما فعالیت پروتئولیتیک افزایش یافته را در حضور عوامل کاهنده (به عنوان مثال، 5 میلی مولار DTT) نشان می دهد، که نشان می دهد کاهش فرضی پیوندهای دی سولفیدی خود منجر به غیرفعال شدن غیرقابل برگشت آن نمی شود. پروتئیناز K توسط مهارکننده های سرین پروتئاز مانند فنیل متیل سولفونیل فلوراید (PMSF)، دی ایزوپروپیل فلوروفسفات (DFP) یا 4-(2-آمینو اتیل) بنزن سولفونیل فلوراید (AEBSF) مهار می شود.

فعالیت پروتئیناز K تحت تأثیر معرف های اصلاح کننده سولفیت مانند اسید پارا-کلرومرکوری بنزوئیک (PCMB)، N-alpha-tosyl-L-lysyl chloromethyl keton (TLCK) یا N-alpha-tosyl-l-phenylalanine chloromethyl keton (TPCK) قرار نمی گیرد. ، اگر چه زمانی که این معرف ها همراه با معرف های دی سولفید احیا کننده که تیول های معمولی در دسترس پروتئیناز K را در معرض دید قرار می دهند، احتمالاً مهار می شود.

پروتئیناز K یکی از بهترین روش‌های استخراج DNA تا به امروز است. روشی دقیق، قابل اعتماد و سریع است. روش استخراج DNA پروتئیناز K به دلیل نقش مهم آنزیم پروتئیناز K در استخراج DNA به عنوان یک روش آنزیمی استخراج DNA نیز نامیده می شود.

روش های آنزیمی اغلب با مواد اولیه ساختار یافته تر در ترکیب با روش های دیگر با بافت ها، مواد گیاهی، باکتری ها و مخمرها استفاده می شود. آنزیم های مورد استفاده به از بین بردن بافت ها و دیواره های سلولی سخت کمک می کنند. بسته به ماده اولیه، درمان‌های آنزیمی معمولی می‌تواند شامل موارد زیر باشد: لیزوزیم، زیمولاز و لیتیکاز، پروتئیناز K، کلاژناز و لیپاز و غیره.

تیمارهای آنزیمی می‌توانند برای پردازش با راندمان بالا قابل قبول باشند، اما ممکن است در مقایسه با سایر روش‌های اختلال هزینه هر نمونه بالاتری داشته باشند.

بخش عمده سلول از پروتئین تشکیل شده است. غشای هسته ای، آنزیم ها، لیگاندها، گیرنده ها، چاپرون ها، آنتی بادی ها و سایر افسانه های خاص گیرنده تنها پروتئین هستند. همچنین غشای سلولی و غشای هسته ای از پروتئین های مرکب مانند فسفولیپید، گلیکوپروتئین و اسفنگومیلین تشکیل شده است. اینها چندین مولکول هستند که از پروتئین ها به همراه برخی لیپیدها، کربوهیدرات ها و سایر مولکول ها تشکیل شده اند.

پروتئیناز K بخش پروتئینی این مولکول ها را هضم می کند. علاوه بر این، پروتئین مرتبط با DNA را هضم می کند. این پروتئین از زنجیره طولانی اسیدهای آمینه تشکیل شده است. بسته به ماهیت تعامل آنها با آب، آن را به اسیدهای آمینه آبدوست (جذب آب) و آبگریز (دفع آب) تقسیم می کنند.

پروتئیناز K عمدتاً اسیدهای آمینه آبگریز (هم معطر و هم آلیفاتیک) را هضم می کند. کوفاکتور، یون کلسیم، ثبات آنزیم را فراهم می کند، با این حال، نمی تواند فعالیت واکنش را افزایش دهد.

با این حال، استفاده از پروتئیناز K در مقایسه با سایر معرف‌های مورد استفاده در روش‌های مختلف مبتنی بر محلول می‌تواند زمان‌بر و پرهزینه باشد، بنابراین تلاش برای یافتن معرف‌های جایگزین به منظور پروتئین زدایی DNA صورت گرفته است.

در سال 1991، لاهیری و نورنبرگر یک پروتکل استخراج DNA از نمونه های خون طراحی کردند که استفاده از حلال های آلی و انکوباسیون طولانی مدت با پروتئیناز K را حذف کرد.

در این پروتکل آنها از (™ P-40 (NP-40; Sigma-Aldrich, St Louis, MO), USA برای لیز خون استفاده کردند. سلول ها و بافرهای نمک بالا و 10% SDS برای غیر فعال کردن و حذف آلاینده ها، و پروتکل دیگر روش اصلاح شده رسوب دهی نمک است که در سال 2005 توسط نصیری و همکاران منتشر شد، که هضم پروتئیناز K را با استفاده از دترجنت جایگزین کرد. این تکنیک اصلاح شده با موفقیت به عنوان یک پروتکل استخراج DNA در بسیاری از تاسیسات در سراسر جهان استفاده شده است.

پروتکل روش استخراج DNA با استفاده از پروتئیناز K :

مواد مورد نیاز :

1. بافر لیزکننده گلبولهای قرمز

2 . بافری که شامل موارد زیر باشد :

• اتیلن دی آمین تترااستیک اسید ( EDTA )
• باز تریس
• کلرید سدیم ( NaCl )

3. سدیم دودسیل سولفات ( SDS )

4. اتانل مطلق و اتانل 70 درصد

5. محلول TE  که شامل _EDTA وباز تریس) می باشد

6. پروتئیناز K

7 . کلرید سدیم (NaCl)

روش و مراحل کار:

در ابتدا نمونه خون را در یک میکروتیوب میریزیم و برای لیز کردن گلبولهای قرمز به آن بافر لیزکننده گلبولهای قرمز  اضافه می کنیم و خوب مخلوط کرده و با دور xg 1000  به مدت 2 دقیقه سانتریفوژ انجام می شود . پس از سانتریفوژ، محلول رویی که حاوی گلبول های قرمز لیز شده و پلاسمای خون می باشد را دور ریخته و مجدداً بافرلیزکننده گلبول های قرمز به میکروتیوب اضافه می کنیم و سپس سانتریفوژ انجام می دهیم .

این کار تا به دست آوردن رسوب سفید رنگ در میکروتیوب ادامــه می یابد. پس از تهیه رسوب سفید، بافر( اتیلن دی آمین تترا استیک اسید ( EDTA )،باز تریس، کلرید سدیم ) به منظور لیز کردن گلبول های سفید به میکروتیوب اضافه کرده و پس از هم زدن، سدیم دودسیل سولفات ( SDS ) به منظور دناتوره کردن پروتئین ها به میکروتیوب اضافه می کنیم و به قدری هم می زنیم تا رسوب کاملاً حل گردد. سپس آنزیم پروتئیناز K به میکروتیوب اضافه کرده و خیلی خوب حل می کنیم.

میکروتیوب ها را به مدت یک ساعت در دمای 55⁰C انکوبه می کنیم. نکته ای که باید به آن توجه کنیم این است که باید حتما هر 5 دقیقه یکبار محتویات میکروتیوب را به هم بزیم. بعد از این مرحله، صد میکرولیتر محلول به لوله اضافه شده و آرام هم می زنیم، سپس به مدت 30 – 10 دقیقه لوله را در یخ قرار داده تا شکلی مشابه ابر، به علت حضور رسوب پروتئین در محلول داخل میکروتیوب مشاهده شود.

در این مرحله میکروتیوب را به مدت 10 دقیقه با دور xg 1000 سانتریفوژ می کنیم. پس از سانتریفوژ محلول شفافی که در بخش بالایی میکروتیوب است  به میکروتیوب های جدید منتقل میکنیم. به محلول رویی جدا شده یک میلی لیتر اتانول مطلق سرد اضــافه میکنیم و بــه آرامــی هــم می زنیم  تا کلافهای شیری رنگ DNA را بینیم.

سپس مدت 10 دقیقه با دور xg  1000  سانتریفوژ نموده و محلول رویی را دور ریخته و بر روی رسوب که همان مولکول های DNA است، باقی مانده اتانل 70 درصد را به منظور  شستشو میریزیم و خوب هم می زنیم و سپس با دور xg  1000 به مدت 2 دقیقه سانتریفوژ می کنیم .

محلول رویی را دور ریخته و میکروتیوب ها را به کمک حرارت در زیر هود و درجه حرارت اتانل خشک می کنیم و سپس به هر یک از میکروتیوب ها 100 میکرولیتر بافر TE یا آب مقطر بدون یون اضافه کرده و به آرامی  و با احتیاط به هم زده تا رسوب DNA حل شود . برای حل شدن بهتر DNA  بهتر است از حرارت 60⁰C  حمام بخار آب جوش استفاده می شود.

برای دریافت خدمات مربوط به استخراج DNA از انواع نمونه ها 

از طریق لینک خدمات آزمایشگاهی می توانید اقدام نمایید

بیشتر بخوانید:

• مروری بر انواع روشهای استخراج DNA