✍  RT-PCR چه تکنیکی است و در چه مواردی کاربرد دارد؟

این تکنیک  نمونه ی الگوی شروع واکنش تکثیر اسیدهای نوکلئیک به جای DNA مولکول RNA  می باشد که به آن RT-PCR (Reverse transcription PCR) گفته می شود.

در بسیاری مواقع که ممکن است نمونه ای که می خواهیم تکثیر کنیم DNA  نباشد مثلا برای بررسی عفونت با ویروس های RNA  دار. ساخت کتابخانه ژنی cDNA به منظور حذف نواحی غیر کننده  و عناصر تنظیمی موجود در DNA ژنومی  و کلون کردن و بیان ژن های یوکاریوتی در پروکاریوت ها و در نهایت مهم ترین کاربرد آن این است که برای بررسی میزان بیان ژن ها به تعیین مقدار mRNA نیاز داریم که در واقع می توان گفت اولین گام برای انجام RealTime PCR سنتز cDNA(Complementry DNA) توسط RT-PCR  می باشد به دلیل اینکه آنزیم DNA پلیمرازی که برای سنتز رشته های جدید در انواع PCR استفاده می شود قادر به استفاده از RNA به عنوان الگو نیست. اساس سنتز cDNA بر مبنای آنزیم نسخه بردار معکوس (Reverse transcriptase) می باشد که قابلیت سنتز DNA تک رشته ای از روی توالی RNA تک رشته ای را دارد و اولین بار در اوایل دهه ۱۹۷۰ از رتروویروس ها خارج شد که در واقع یک DNA پلیمراز وابسته به RNA  هست که چندین نوع از این آنزیم وجود دارد:AMV ، MMLV ،HIV-1  و آنزیم نسخه بردار معکوس تلومرازی.

از دیگر مواد مهم برای سنتز cDNA پرایمرها هستند که برای این کار ۳ نوع پرایمر وجود دارد:

پرایمرهای Random Hexamer: توالی های کوچک ۶ نوکلئوتیدی که به صورت تصادفی به هر جایی از RNA امکان اتصال دارند. این پرایمرها زمانی که بخواهیم بیان تمام ژن ها را تحت هر شرایطی با هر ژن کنترلی حتی rRNA 18s  بررسی کنیم کاربرد دارد.

پرایمرهای OligodT: این پرایمرها به انتهای mRNA  دارای توالی polyA  متصل می شوند.

پرایمرهای اختصاصی: این پرایمرها برای نقاط  شناخته شده ای از mRNA ها با توالی مشخص طراحی می شوند و در واقع باعث بهینه سازی توالی مورد نظر می گردند و در کلونینگ کاربرد دارند. مواد دیگری که در سنتز cDNA نقش دارند شامل نوکلئوتیدها( dNTPها)، بافر آنزیم RT، آنزیم ریبونوکلئاز وRNase H  که وظیفه ی جداسازی دو رشته ی RNA  و cDNA  سنتز شده از هم را دارد، می باشد . که معمولا همه این مواد به صورت مخلوطی در کیت های سنتز cDNA در ویالی تحت عنوان Master Mix موجود می باشد و نیازی به افزودن آن ها به صورت جداگانه نیست.

برخی کیت ها به صورت One step و برخی Two step می  باشند. در حالت  Two step ابتدا سنتز cDNA  در یک ویال انجام می شود و سپس PCR معمولی در جهت بررسی بیان ژن cDNA سنتزشده در ویالی دیگر انجام می شود. این کیت ها دقت بیشتری دارند  و Trouble shooting  هر مرحله آسان تر می باشد.

در حالت One step همه ی مراحل سنتز cDNA تا بیان ژن در یک ویال انجام می گیرد و برای افرادی که تسلط زیادی دارند مناسب تراست. برای انجام این تکنیک ابتدا استخراج RNA موجود در نمونه مورد نظر انجام می شود. RNA استخراج شده جهت سنتز cDNA باید کیفیت و غلظت مناسبی داشته باشد چون چیزی معادل ۱μg یا همان ۱۰۰۰ng از RNA در هر بار استفاده جهت سنتز مورد نیاز است. سپس RNA  مورد نظر را با موادی که در بالا گفته شد بر روی یخ مخلوط کردیم ویال را به دستگاه  ترموسایکلر منتقل می کنیم تا دماهای لازم را با برنامه زمانی که بسته به کیت متفاوت است اعمال کنیم.

مراحل مشترک در کیت های مختلف:

افزایش دما تا ۶۵ درجه به مدت ۵ دقیقه  برای باز شدن پیچ و تاب ها و ساختار های ثانویه RNA دمای حدود۴۰ (۴۲-۳۷) درجه به مدت یک ساعت به منظور فعال شدن آنزیم RT  که این دما بسته به نوع آنزیم RT می تواند تغییر کند. دمای ۸۰-۷۰ در حدود ۵ دقیقه برای غیر فعال کردن آنزیم RT cDNA سنتز شده را می توان در دمای ۲۰- درجه به مدت طولانی نگهداری کرد و دیگر استرس تخریب آن با آنزیم RNase که در محیط فراوان است را نیز نداشت.

برای بررسی کیفیت cDNA باید برای یک ژن House keeping  که میزان بیان آن در همه سلول ها تحت هر شرایطی یکسان است به عنوان مبنا و رفرنس  یک PCR معمولی بگذاریم و نتیجه را روی ژل آگارز مشاهده کنیم چنانچه باند SHARP و در جایگاه درستی از لحاظ طول بود نتیجه می گیریم کیفیت cDNA مناسب است و با خیال راحت می توانیم به سراغ انجام مراحل بعدی RealTime PCR جهت بررسی بیان ژن ها  رفت.