تکنیک ARMS PCR و کاربرد آن در آزمایشگاه ژنتیک
تکنیک ARMS PCR با نام کامل Amplification Refractory Mutation Syestem یک روش مطمئن و سریع برای شناسایی جهش های نقطه ای و پلی مورفیسم ها و حذف های کوچک است. از ARMS PCR می توان برای جداسازی آلل های یک ژن که حتی در حد یک جفت باز هستند و هم چنین برای تعیین ژنوتیپ و جدا کردن افراد هموزیگوت و هتروزیگوت از نظر یک لوکوس ژنی از هم استفاده کرد. دلیل نام گذاری این تکنیک مقاوم بودن(Refractory) به تکثیر، پرایمر دارای آلل نرمال در تیوب حاوی DNA الگوی موتانت و پرایمر حاوی آلل موتانت در تیوب حاوی DNA الگو با آلل نرمال می باشد. به ARMS PCR گاها MAMA PCR(Mismatch amplification mutation assay(نیز گفته می شود.
آزمایش ARMS PCR به سه روش Standard(برای شناسایی یک جهش نقطه ای با استفاده از 3 پرایمر)، Multiplex(شناسایی چندین جهش نقطه ای روی یک ژن با استفاده از چندین پرایمر)، Double(بررسی ارتباط نواحی پلی مورفیک ژن های روی یک کروموزوم با استفاده از پرایمر اختصاصی)
تشخیص هتروزیگوت یا همزیگوت با استفاده از آغازگرهای(پرایمرهای) ARMS PCR برای آلل های جهش یافته(پلی مورفیک) و نرمال متفاوت است. واکنش ها برای تشخیص جهش و آلل های معمولی معمولاً در لوله های جداگانه انجام می شود. اما می توان با استفاده از برچسب زدن(Labelling) دو پرایمر با رنگ های مختلف فلورسنت در همان لوله انجام شود.
کاربردهای تکنیک ARMS PCR
شناسایی جهش های تک نوکلئوتیدی در تشخیص پیش از تولد بیماری های ژنتیکی، تشخیص تومور در حین درمان و شناسایی افراد ناقل بیماری موثر است. با استفاده از این تکنیک 12 جهش متفاوت بر روی پروتیئن CFTR مربوط به بیماری فیبروز سیستیک(Cystic Fibrosis) قابل شناسایی می باشد. همچنین بررسی ژن JAK2 برای اختلالات احتمالی مغز استخوان با استفاده از ARMS PCR امکانپذیر می باشد.
طراحی پرایمر ARMS PCR
در مطلب مربوط به تکنیک RFLP گفته شد که گاهی برای جهش و پلی مورفیسم مورد نظرمان آنزیم محدودگر مناسبی وجود ندارد لذا باید از تکنیک دیگر استفاده کنیم که یکی از مهم ترین و آسان ترین آنها ARMS PCR است اما تکنیک ARMS PCR هم محدودیت های خاص خودش را دارد به ویژه از لحاظ طراحی پرایمر چرا که پرایمر اختصاصی دارد که اساسی ترین رکن این تکنیک است. این پرایمر های اختصاصی فقط زمانی باعث تکثیر می شوند که آلل مورد نظرمان در نمونه موجود باشد و چنانچه جهشی رخ داده باشد و آلل موتانت باشد و پرایمر طراحی شده برای آلل نرمال باشد پرایمر ما دیگر قادر به تکثیر نمونه نمی باشد.
برای این تکنیک باید 3 پرایمر اختصاصی طراحی کنیم که در واقع 2 پرایمر Reverse و یا 2 پرایمر Forward به گونه ای طراحی می کنیم که انتهای ‘3 یکی از آن ها آلل موتانت (جهش یافته) و انتهای ‘3 پرایمر دیگر آلل نرمال یعنی جهش نیافته باشد و حال فرض کنید انتهای ‘3 پرایمرهای Forward را اختصاصی طراحی کردیم پس باید یک پرایمر Reverse با فاصله ی مناسب از پرایمرهای Forward طراحی کنیم. اینکه کدام یک از پرایمرهای F یا R را اختصاصی برای آلل طراحی کنیم بستگی به این دارد که از کدام سمت شرایط طراحی پرایمر مناسب تر باشد.
پروتکل انجام آزمایش ARMS PCR
از آن جایی DNA پلیمرازهایی مثل Taq polymerase خاصیت اگزونوکلئازی ‘3 به ‘5 ندارند برای این تکنیک مناسبند چون چنانچه mismatch در انتهای ‘3 بین پرایمر و DNA الگو باشد بازده تکثیر به شدت کاهش پیدا می کند بنابراین نمی توان از DNA پلیمرازهایی با high fidelity مثل pfu و vent استفاده کرد ولی علاوه بر این اضافه کردن یک mismatch دیگر در نزدیکی موقعیت انتهای ‘3 حدود 5 نوکلئوتید مانده به انتهای ‘3 باعث می شود آزمایش به درستی انجام شود و اختصاصیت واکنش افزایش پیدا کند.
بدین منظور از 2 تیوب برای هر نمونه استفاده می کنیم که در هر دو تیوب از یک نمونه DNA استفاده می کنیم ولی در تیوب اول از پرایمری استفاده می کنیم که اختصاصی آلل نرمال باشد و در تیوب دوم از پرایمری استفاده می کنیم که اختصاصی آلل موتانت باشد حال بسته به اینکه DNA مورد نظر حاوی چه آللی می باشد در یکی از تیوب ها واکنش تکثیر انجام می شود این نشان می دهد که فرد هموزیگوت است و چنانچه تکثیر در هر دو تیوب رخ دهد فرد دارای هر دو آلل نرمال و موتانت می باشد و هتروزیگوت است. لذا از این طریق می توان افراد را از نظر یک لوکوس ژنی تعیین ژنوتیپ کرد.
برای اینکه مطمئن شویم عدم تکثیر در هر یک از تیوب ها به دلیل عدم حضور آلل مکمل با انتهای ‘3 پرایمرهست بهتر است از یک جفت پرایمر کنترل داخلی که در نواحی از DNA که فاقد جهش مورد بررسی ماست متصل می شود و قطعه بزرگتری تکثیر می کند استفاده کرد و از درستی واکنش PCR اطمینان پیدا کرد. در شرایط منفی کاذب هیچ کدام از پرایمرهای اختصاصی جهش و کنترل داخلی تکثیر نمی شوند و باید به سایر شرایط و مواد مورد استفاده در واکنش PCR را بررسی کنیم و از صحت آن ها اطمینان حاصل کنیم.
ARMS PCR
پس از انجام واکنش PCR در ترمال سایکلر نتایج را روی ژل الکتروفورز پلی آکریل آمید یا ژل آگارز عمدتا 3% مشاهده می کنیم و تعیین ژنوتیپ میسر می شود.
بیشتر بخوانید: