تکنیک Nested PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز تودرتو)
تکنیک Nested PCR نوعی PCR است که حساسیت و اختصاصیت بالایی دارد. این تکنیک به منظور کاهش اتصالات غیر اختصاصی در محصولات مورداستفاده قرار می گیرد. در سال 1988 این تکنیک توسط Rechitsky و Storm مطرح گردید و به خاطر نحوه ی قرار گرفتن پرایمر های مورد استفاده در واکنش اول و دوم نسبت به هم Nested (تودرتو) نامگذاری شد. این روش درصورتی به کار می رود که نیاز فراوانی به حساسیت و اختصاصیت در PCR احساس شود.
گاهی در PCR عادی پرایمر ها به طور نادرست به DNA هدف متصل شده و قطعات غیراختصاصی نسبت به پرایمر تکثیر می شود و به هر میزان که تعداد سیکل های PCR و مدت زمان Extension ثانویه بیشتر باشد احتمال اتصال نادرست افزایش می یابد، در چنین شرایطی اگر طراحی پرایمر بهتری که به درستی به توالی هدف متصل شود برای ما میسر نباشد برای افزایش حساسیت و اختصاصیت واکنش می توان از Nested PCR استفاده کرد. حتی در مواقعی که کیفیت DNA ما مناسب نیست و مقدار آن در نمونه بسیار کم است، استفاده از این تکنیک می تواند باعث افزایش تولید محصول هدف تا چندین برابر محصول تولید شده در PCR معمولی شود.
مراحل انجام Nested PCR
استخراج DNA هدف
واکنش زنجیره پلی مراز(PCR) اول
واکنش زنجیره پلی مراز (PCR) دوم
آنالیز محصولات تشکیل شده توسط الکتروفورز در ژل و مشاهده آن ها به کمک رنگ آمیزی اتیدیوم برومید(ایجاد محصولات مناسب در دور دوم واکنش، اختصاصیت واکنش را تایید می کند.)
استخراج محصول موردنظر ازباند مربوط به آن در ژل در صورت نیاز و به دنبال آن توالی یابی(sequencing) انجام می شود.
تکنیک Nested PCR در واقع دارای 2 فرایند PCR متوالی است که هر کدام از 30 سیکل تشکیل شده در PCR اول از یک جفت پرایمر خارجی Outer Primers که در خارج از توالی هدف متصل می شوند استفاده می شود و درنهایت قطعات بزرگتری نسبت به توالی موردنظرمان تکثیر می شود.
در واکنش PCR دوم از یک جفت پرایمر Nested یا به عبارتی Inner Primers پرایمرهای داخلی استفاده می شود، که در محلی میان دو پرایمر مورد استفاده درواکنش PCR اول به توالی موردنظرمان اتصال پیدا می کند و در نتیجه قطعات کوتاه تری نسبت به محصولات PCR اول ایجاد می شود . در صورتی که پرایمرهای داخلی ما در واکنش PCR دوم منجر به تولید محصول شود، تأکیدی بر صحت واکنش اول و اختصاصی بودن محصول حاصل از آن می باشد .
یک مرحله انتقال هم بین دو مرحله ی اول و دوم PCR وجود دارد که محصولات حاصل از واکنش PCR اول به تیوب واکنش PCR دوم منتقل می شود البته برای نتیجه بهتر لازم است که مقدار پرایمرهای داخلی بیشتر از پرایمر خارجی باشد . از معایب این تکنیک می توان به این موضوع اشاره کرد که در مرحله انتقال و استفاده از دو تیوب مجزا احتمال آلودگی محیط آزمایشگاه با محصول PCR افزایش می یابد.
انواعNested PCR
Semi-nested PCR: در این روش درواکنش PCR اول از دو پرایمر خارجی و در واکنشPCR دوم از یک پرایمرداخلی و یکی از پرایمر های خارجی مورد استفاده در واکنش اول استفاده می شود و در نهایت اختصاصیت تقویت می شود.
Pit-stop PCR : این تکنیک هم دقت و اختصاصیت Nested PCR و هم سرعت PCR معمولی را دارد از این رو بهبود یافته و مؤثرتراست. در این تکنیک تعداد سیکل های واکنش PCR اول را تا حدود 10 سیکل کاهش می دهند و مقدار بسیار کمی از آن را به عنوان نمونه برای واکنش PCR دوم که تعداد سیکل های آن بیش از 20 سیکل هست استفاده می کنند.هم چنین در این روش مانند Nested PCR از جفت پرایمر جدیدی به عنوان پرایمر داخلی استفاده می شود.
برای یادگیری تکنیک های مورد نیاز برای کار در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.
بیشتر بخوانید: