✍ بررسی روش های اصلی تکنیک های وابسته به PCR را که به منظور بررسی متیلاسیون برخی نواحی خاص از DNA مانند جزایر CpG به کار می رود 

روش اول، عدم اعمال بی سولفیت:

در این حالت DNA ژنومی بدون هیچ تغییری و به صورت مستقیم به کار گرفته می شود و از اندونوکلئازهای محدودکننده حساس به متیلاسیون در ترکیب با روش های تشخیصی مثل ساترن بلاتینگ و PCR استفاده می شود.

روش دوم، اعمال بی سولفیت:

در تمام روش های مرتبط با بی سولفیت،DNA تغییر یافته در اثر اعمال بی سولفیت به وسیله تکنیک PCR تکثیر می یابد.

یکی از روش های معروف اعمال بی سولفیت،MSP  می باشد که به طور مفصل به بررسی این روش خواهیم پرداخت.

سدیم بی سولفیت اولین بار در سال ۱۹۹۲ به وسیله Frommer و همکارانش معرفی گردید که بررسی متیلاسیون سیتوزین ها را امکانپذیر ساخت زیرا باعث تغییر در DNA ژنومی و فیکس کردن الگوی متیلاسیون می شود و در نهایت منجر به پیشرفت های زیادی در این زمینه تحقیقات شد.

سدیم بی سولفیت باعث دآمیناسیون سیتوزین‌های متیله ‌نشده در موقعیت ۴ آن‌ها می شود و آن‌ها را به یوراسیل تبدیل کرده و در نهایت توالی را تغییر می دهد و پس از تکثیر به روش PCR یوراسیل ها به تیمین تبدیل می شوند. در صورتی که، سیتوزین‌های متیله‌ شده (۵-متیل سیتوزین) به دآمیناسیون به وسیله سدیم بی سولفیت مقاوم هستند و تغییری نمی کنند و پس از PCR نیز به صورت سیتوزین ها به صورت سیتوزین باقی می مانند، که در نهایت با اعمال توالی یابی؛ با مقایسه DNA قبل و بعد از تیمار با بی سولفیت می توان سیتوزین های متیله شده را تشخیص داد. البته به غیر از تکنیک توالی یابی، راه های بسیار زیادی برای بررسی تغییرات ایجاد شده در اثر تیمار DNA با سدیم بی سولفیت وجود دارد. وضعیت توالی‌های مشخص CpG در ژنوم را می توان به وسیله تجزیه با آنزیم محدودکننده و یا  (MSP-PCR) بررسی نمود. تغییر باز آدنین به باز تیمین می‌تواند باعث ایجاد جایگاه تشخیصی خاص و یا از بین رفتن آن شود.

تکنیک PCR اختصاصی متیلاسیون (Methylation-specific PCR) 

این تکنیک که به اختصار MSP  گفته می شود، در سال ۱۹۹۶ به وسیله Herman و همکارانش شناسایی و معرفی گردید

این تکنیک کاربرد گسترده ای در بررسی جزایر CpG پروموتر ها دارد و از دو بخش اصلی تشکیل شده است:

۱- سیتوزین‌های متیله‌ نشده در اثر سدیم بی‌سولفیت به یوراسیل تبدیل شده، در صورتی که سیتوزین‌های متیله‌ شده تغییری نمی کنند.

۲_ بررسی تفاوت‌های توالی تیمار شده با بی‌سولفیت تحت تاثیر PCR، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی هر دو نوع DNA متیله و غیرمتیله.

اساس کار قرار دادن توالی‌های دارای CpG تحت تاثیر سدیم بی سولفیت است که به طور قطع الل‌هایی که CpGهایشان متیله هستند نسبت به آن‌هایی که غیرمتیله هستند، توالی متفاوتی را حاصل خواهد کرد سپس از دو جفت پرایمر اختصاصی توالی‌های متیله شده و متیله نشده برای ژن موردنظر استفاده می کنیم که  پرایمر متیله‌ نشده (UMP)، تنها مولکول DNA ای را که در اثر سدیم بی سولفیت تغییر کرده است را تکثیر می‌کند در حالیکه، که پرایمر متیله‌ شده (MSP)، مخصوص DNA متیله شده تغییر یافته در اثر سدیم بی سولفیت می‌باشد.

تفسیر نتایج هم بسیار آسان می باشد و به وسیله الکتروفورز هر دو در کنار هم به صورت هم زمان جهت مقایسه آن ها می باشد که در حالیکه اندازه محصولات PCR که روی ژل آگارز می بینیم، طبق انتظار باشد، بنابر نوع پرایمر مورد استفاده، درمی یابیم که نمونه دارای الل متیله شده و یا غیرمتیله ژن است.

با تکنیک‌های توالی یابی بی سولفیت و pyrosequencing نیز می توان متیلاسیون را بررسی نمود. همه ی این تکنیک ها مبتنی بر PCR می باشند.

مزیت های تکنیک MSP:

* سادگی تکنیک

*نیاز به مقدار کم تری نمونه DNA در مقایسه با ساترن بلاتینگ با استفاده از آنزیم‌های محدودکننده حساس به متیلاسیون

*تفسیر نتایج بسیار آسان‌تر

*سرعت انجام تکنیک :MSP در یک یا دو روز انجام می شود و نسبت به توالی یابی بی سولفیت که نیاز به کلونینگ و توالی یابی دارد و چندین روز زمان می گیرد سریع تر است.

*تطبیق‌پذیری MSP با انواع کاربردها

*حساسیت بالا(قدرت تشخیص یک الل متیله‌ شده در ازای ۱۰۰۰ الل متیله‌ نشده)

*مقرون به صرفه بودن آن

محدودیت های تکنیکMSP:

*تکنیک MSP کمی نیست: این تکنیک فقط حضور یا عدم حضور متیلاسیون را در ناحیه موردنظر تعیین می‌کند.

*نتایج کاذب: این امکان وجود داری که علاوه بر نتایج حقیقی، نتایج کاذب را نیز به صورت نمایی تکثیر ‌کند. به همین دلیل، میزان موفقیت تاثیر بی سولفیت باید با استفاده از کنترل‌ها، در تمام آزمایشات مانیتور کرد تا از درست بودن نتایج مطمئن شویم. از دلایل ایجاد کننده ی نتایج کاذب می توان به دناتوراسیون ناقص مولکول DNA و تغییر یافتن متیل‌ سیتوزین‌های واقع در بخش‌های تک‌ رشته‌ای و دست نخورده ماندن بخش دورشته‌ای، تغییر یافتن ناقص مولکول‌های تحت تاثیر قرار گرفته، اتصال دوباره مولکول‌های DNA تحت تاثیر غلظت بالای نمک و دسولفوناسیون ناقص اشاره کرد. با استفاده از کیت‌های تجاری بهینه‌شده می‌توان احتمال وقوع این موارد را کاهش داد.

کاربردهای بالینی تکنیک MSP:

*آنالیز بیماران دارای نقص در متیلاسیون DNA

*آنالیز وضعیت هر گونه تولی DNA مانند ژن‌های ویروسی و ژن‌های حک‌گذاری شده وابسته به X و یا اتوزومی

* بررسی میزان پاسخ بیماران سرطانی به داروهای آلکیله‌ کننده

* استفاده از MSP جهت هایپرمتیلاسیون آنزیم MGMT که در ترمیم DNA نقش دارد

* هایپرمتیلاسیون و غیرفعال شدن ژن‌های سرکوب کننده تومور

تکنیک های تشخیص متیلاسیون DNA