تشخیص متیلاسیون DNA با PCR اختصاصی متیلاسیون
متیلاسون
از تغییرات مهم اپی ژنتیکی می توان متیلاسیون DNA را نام برد که در سلول های یوکاریوتی اتفاق می افتد، که نقش به سزایی در تنظیم بیان ژن و محافظت از یکپارچگی DNA دارد. ژنوم انسان از تقریباً 1٪ سیتوزین متیله تشکیل شده است که آن را فراوان ترین و گسترده ترین اصلاح DNA می نامند. در حین متیلاسیون DNA یک گروه متیل توسط آنزیم DNA متیل ترانسفراز (DNMT)، بعد از همانندسازی به کربن شماره 5 حلقه پریمیدین سیتوزین اضافه می شود و در نهایت 5-متیل سیتوزین(5mC) تولید می شود.
متیلاسیون DNA فقط در بازهای سیتوزینی که در سمت ‘5 گوانوزین قرار دارند و به آن ها دی نوکلئوتیدهای CpG گفته می شود اتفاق می افتد. لازم به ذکر است که متیلاسیون DNA از جفت شدن باز ها جلوگیری نمی کند زیرا گروه متیل خارج از مارپیچ دو رشته ای است. اگر در پروموتر متیلاسیون رخ دهد، باعث تغییر در اتصال فاکتورهای رونویسی و سایر پروتئین ها به DNA می شود و در نهایت پروتئین های methyl CpG binding (MeCpG) و هیستون دِاستیلازها وارد عمل می شوند و باعث فشرده شدن کروماتین در اطراف محل شروع رونویسی ژن می شوند.
در ژنوم انسان فقط نواحی بسیار کوچکی که جزایر CpG نام دارند و در نواحی پروموتری بسیاری از ژن ها یافت می شوند، دارای دی نوکلئوتیدهای CpG هستند که این موضوع به دلیل از بین رفتن آن ها طی تکامل است که به تمایل متیل سیتوزین ها به طور خود به خودی به تیمین ها مربوط است. این جزایر در ناحیه پروموتر چه در شرایط فعال چه غیر فعال بسیار در برابر متیلاسیون محافظت شده اند، ولی گاهی دچار متیلاسیون می شوند و این موضوع باعث خاموشی ژن می شود که مثال آن را دو کروموزوم های X غیر فعال می توان دید.
متیلاسیون سیتوزین ها در DNA ژنومی نقش به سزایی در تنظیم بیان ژن ها دارد و در مطالعات سرطان نیز بسیار حائز اهمیت است که سه مکانیزم مرتبط آن در سرطان، خاموش کردن ژن های سرکوب کننده تومور در هایپر متیلاسیون نواحی پروموتر، هایپومتیلاسیون پروتوانکوژن ها که باعث عدم توانایی مهار آن ها و در نهایت هایپومتیلاسیون کل ژنوم (نئوپلازی) که باعث افزایش نرخ جهش و ناپایداری کروموزوم می شود، می باشد.
برای تشخیص متیلاسیون DNA از روشهای مختلفی استفاده می شود که یکی از آنها استفاده از PCR اختصاصی متیلاسیون است. برای مطالعه وضعیت متیلاسیون نواحی خاصی از DNA، مانند جزایر CpG موجود در پروموترها، روشهای خاصی مورد استفاده قرار می‌گیرند که دو متد اصلی به این منظور وجود دارد:
- عدم اعمال بی سولفیت
در این متد DNA ژنومی بدون هیچ تغییری و به صورت مستقیم به کار گرفته می شود و از اندونوکلئازهای محدودکننده حساس به متیلاسیون در ترکیب با روش های تشخیصی مثل ساترن بلاتینگ و PCR استفاده می شود.
- اعمال بی سولفیت
در تمام روش های مرتبط با بی سولفیت، DNA تغییر یافته در اثر اعمال بی سولفیت به وسیله تکنیک PCR تکثیر می یابد. یکی از روش های معروف اعمال بی سولفیت،methylation-specific PCR (MSP) می باشد که به طور مفصل به بررسی این روش خواهیم پرداخت.
سدیم بی سولفیت اولین بار در سال 1992 به وسیله Frommer و همکارانش معرفی گردید که بررسی متیلاسیون سیتوزین ها را امکانپذیر ساخت زیرا باعث تغییر در DNA ژنومی و فیکس کردن الگوی متیلاسیون می شود و در نهایت منجر به پیشرفت های زیادی در تحقیقات این زمینه شد.
سدیم بی سولفیت باعث دِآمیناسیون سیتوزین‌های متیله نشده در موقعیت ۴ آنها می شود و آنها را به یوراسیل تبدیل کرده و در نهایت توالی را تغییر می دهد و پس از تکثیر به روش PCR یوراسیل ها به تیمین تبدیل می شوند. در صورتی که، سیتوزین های متیله شده (۵-متیل سیتوزین) به دآمیناسیون به وسیله سدیم بی سولفیت مقاوم هستند و تغییری نمی کنند و پس از PCR نیز به صورت سیتوزین ها به صورت سیتوزین باقی می مانند، که در نهایت با اعمال توالی یابی؛ با مقایسه DNA قبل و بعد از تیمار با بی سولفیت می توان سیتوزین های متیله شده را تشخیص داد.
به غیر از تکنیک توالی یابی، راه های بسیار زیادی برای بررسی تغییرات ایجاد شده در اثر تیمار DNA با سدیم بی سولفیت وجود دارد. وضعیت توالی‌های مشخص CpG در ژنوم را می توان به وسیله تجزیه با آنزیم محدودکننده و یا (MSP-PCR) بررسی نمود. تغییر باز آدنین به باز تیمین می‌تواند باعث ایجاد جایگاه تشخیصی خاص و یا از بین رفتن آن شود.
PCR اختصاصی متیلاسیون
این تکنیک که به اختصار MSP یا (Methylation-specific PCR) گفته می شود، در سال 1996 به وسیله Herman و همکارانش شناسایی و معرفی گردید. تکنیک MSP کاربرد گسترده در بررسی جزایر CpG پروموتورها دارد و از دو بخش اصلی تشکیل شده است:
1- سیتوزین های متیله نشده در اثر سدیم بی‌سولفیت به یوراسیل تبدیل شده، در صورتی که سیتوزین های متیله شده تغییری نمی کنند.
2- بررسی تفاوت های توالی تیمار شده با بی‌سولفیت تحت تاثیر PCR، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی هر دو نوع DNA متیله و غیرمتیله.
متدولوژی
اساس کار قرار دادن توالی های دارای CpG تحت تاثیر سدیم بی سولفیت است که به طور قطع الل‌هایی که CpG هایشان متیله هستند نسبت به آن هایی که غیرمتیله هستند، توالی متفاوتی را حاصل خواهد کرد. سپس از دو جفت پرایمر اختصاصی توالی های متیله شده و متیله نشده برای ژن موردنظر استفاده می کنیم که پرایمر متیله نشده(UMP)، تنها مولکول DNA ای را که در اثر سدیم بی سولفیت تغییر کرده است را تکثیر می کند در حالیکه، که پرایمر متیله شده(MSP)، مخصوص DNA متیله شده تغییر یافته در اثر سدیم بی سولفیت می‌باشد.
تفسیر نتایج هم بسیار آسان می باشد و به وسیله الکتروفورز، هر دو در کنار هم به صورت هم زمان جهت مقایسه آن ها می باشد. در حالی که اندازه محصولات PCR که روی ژل آگارز می بینیم، طبق انتظار باشد، بنابر نوع پرایمر مورد استفاده، درمی یابیم که نمونه دارای الل متیله شده و یا غیرمتیله ژن است. با تکنیک های توالی یابی بی سولفیت و پایروسکانس نیز می توان متیلاسیون را بررسی نمود. همه ی این تکنیک ها مبتنی بر PCR می باشند.
مزیت های تکنیک MSP
- سادگی تکنیک
- نیاز به مقدار کمتری نمونه DNA در مقایسه با ساترن بلاتینگ با استفاده از آنزیم‌های محدودکننده حساس به متیلاسیون
- تفسیر نتایج بسیار آسان‌تر
- تطبیق‌پذیری تکنیک MSP با انواع کاربردها
- حساسیت بالا(قدرت تشخیص یک الل متیله شده در ازای ۱۰۰۰ الل متیله نشده)
- مقرون به صرفه بودن
- سرعت انجام تکنیک MSP، در یک یا دو روز انجام می شود و نسبت به توالی یابی بی سولفیت که نیاز به کلونینگ و توالی یابی دارد و چندین روز زمان می گیرد سریع تر است.
محدودیت های تکنیک MSP
- تکنیک MSP کمی نیست. این تکنیک فقط حضور یا عدم حضور متیلاسیون را در ناحیه موردنظر تعیین می‌کند(روش کیفی).
- نتایج کاذب: این امکان وجود داری که علاوه بر نتایج حقیقی، نتایج کاذب را نیز به صورت نمایی تکثیر کند. به همین دلیل، میزان موفقیت تاثیر بی سولفیت باید با استفاده از کنترل‌ها، در تمام آزمایشات مانیتور کرد تا از درست بودن نتایج مطمئن شویم.
از دلایل ایجاد کننده ی نتایج کاذب می توان به دناتوراسیون ناقص مولکول DNA و تغییر یافتن متیل سیتوزین‌های واقع در بخش‌های تک رشته‌ای و دست نخورده ماندن بخش دو رشته‌ای، تغییر یافتن ناقص مولکول‌های تحت تاثیر قرار گرفته، اتصال دوباره مولکول‌های DNA تحت تاثیر غلظت بالای نمک و دِسولفوراسیون ناقص اشاره کرد. با استفاده از کیت‌های تجاری بهینه‌شده می‌توان احتمال وقوع این موارد را کاهش داد.
کاربردهای بالینی تکنیک MSP
- آنالیز بیماران دارای نقص در متیلاسیون DNA
- آنالیز وضعیت هر گونه تولی DNA مانند ژن‌های ویروسی و ژن‌های حک‌گذاری شده وابسته به X و یا اتوزومی
- بررسی میزان پاسخ بیماران سرطانی به داروهای آلکیله کننده
- استفاده جهت هایپرمتیلاسیون آنزیم MGMT که در ترمیم DNA نقش دارد
- هایپرمتیلاسیون و غیرفعال شدن ژن‌های سرکوب کننده تومور
برای دریافت خدمات مربوط تکنیک متیلاسیون DNA و انجام انواع تست های ژنتیک مولکولی
از طریق لینک خدمات آزمایشگاهی می توانید اقدام نمایید
بیشتر بخوانید:
