مروری بر انواع روشهای استخراج DNA

سیر تکاملی روشهای استخراج DNA

در ابتدای این مقاله جامع مختصری از تاریخچه دستیابی به اسیدهای نوکلئیک و روش های استخراج DNA را مرور خواهیم کرد، سپس پروتکل انواع روش های استخراج DNA از نمونه های مختلف را بررسی می نماییم.

فردریش میشر اولین دانشمندی بود که DNA را در حین مطالعه ترکیب شیمیایی سلول ها جدا کرد و کاشف اسیدهای نوکلئیک شد. در سال 1869، او از لکوسیت‌هایی که از نمونه‌ها روی باندهای جراحی تازه جمع‌آوری کرده بود استفاده کرد و آزمایش‌هایی را برای خالص‌سازی و طبقه‌بندی پروتئین‌های موجود در این سلول‌ها انجام داد. میشر در طی آزمایشات خود ماده جدیدی را در هسته‌ها شناسایی کرد که آن را «نوکلئین» نامید. سپس دو پروتکل برای جدا کردن هسته سلول‌ها از سیتوپلاسم و جداسازی این ترکیب جدید، که امروزه به نام DNA شناخته می‌شود، ایجاد کرد، که با پروتئین‌ها و سایر مواد متفاوت است.

درک ما از ماده ژنتیکی از زمانی که فریدریش میشر اولین استخراج DNA را انجام داد، به طور قابل توجهی افزایش یافته است. اولین استخراج، کشف ساده ای بود که نشان داد ماده ای در سلول ها وجود دارد که از محلول خارج می شود و به محلول قلیایی می رسد. سال 1953 ساختار DNA مشخص شد. اندکی پس از آن، روش های آزمایشگاهی استاندارد برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک پدیدار شد.

استخراج DNA از نمونه های مختلف مایعات بدن(خون، بزاق و …)، بافت های زنده و فیکس شده، سلول ها، باکتری ها و …امکان پذیر می باشد که با وجود پروتکل های متنوعی که برای هر کدام وجود دارد، وجه اشتراک همه ی آن ها جدا کردن DNA از سایر اجزای سلولی است. محتوای بدست آمده مواد سلولی این یافته علمی، همراه با پروتکل‌های جداسازی مورد استفاده، در سال 1871 با همکاری استاد او، فلیکس هوپ سیلر، منتشر شد. آن ها استخراج DNA از نمونه های باکتری اشرشیاکلی را با استفاده از پروتکل سانتریفوژ با گرادیان چگالی نمک انجام دادند. از آن زمان، تکنیک های استخراج DNA برای انجام استخراج بر روی انواع مختلف منابع بیولوژیکی اقتباس شده است.

استخراج DNA از زمانی که انجام شده، به طور قابل توجهی تکامل یافته است. این اولین مرحله مورد نیاز برای بسیاری از تکنیک های زیست شناسی مولکولی است. نمونه های خون کامل یکی از منابع اصلی مورد استفاده برای به دست آوردن DNA هستند و پروتکل های مختلفی برای استخراج اسید نوکلئیک روی این نمونه ها وجود دارد. این روش‌ها از پروتکل‌های دستی بسیار ابتدایی تا روش‌های پیچیده‌تر موجود در پروتکل‌های استخراج DNA خودکار متفاوت هستند.

بر اساس طیف گسترده ای از گزینه های موجود، انتخاب گزینه هایی که بهترین عملکرد را از نظر مقرون به صرفه بودن و بازده زمانی دارند، ایده آل خواهد بود. بر اساس تحقیقات خود، به این نتیجه رسیده ایم که شواهد علمی کافی برای حمایت از یک روش خاص استخراج DNA از نمونه های خون کامل وجود ندارد. انتخاب یک روش مناسب هنوز فرآیندی است که نیازمند در نظر گرفتن عوامل مختلف است و تحقیقات بیشتری برای تایید انتخاب های انجام شده در تاسیسات در سراسر جهان مورد نیاز است.

در ابتدا، پروتکل‌ها و مراحلی را با هدف دستیابی به لیز سلولی، غیرفعال کردن آنزیم‌های سلولی، دناتوره‌سازی کمپلکس‌های سلولی و رسوب DNA مورد بحث قرار می‌دهیم که به روش‌ها و یا معرف‌های مشابه در طول استخراج DNA از نمونه‌های خون کامل نیاز دارند. تفاوت‌های کلیدی در مراحل حذف آلاینده‌های بیولوژیکی و شیمیایی، زمانی برجسته می‌شود که هر پروتکل را به تفصیل مورد بحث قرار دهیم.

لیز سلول ها یک مرحله رایج در اکثر پروتکل های استخراج DNA است و معمولاً از طریق استفاده از مواد دترجنت(شوینده) و آنزیم ها به دست می آید. سدیم دودسیل سولفات(SDS) و Triton™ X-100، نمونه‌هایی از شوینده‌های کاربردی هستند که برای حل کردن غشای سلولی استفاده می‌شوند.

آنزیم ها همچنین با مواد شوینده ترکیب می شوند تا سطح سلول یا اجزای سیتوزولی را هدف قرار دهند. پروتئیناز K یک آنزیم رایج مورد استفاده در پروتکل های مختلف برای جدا کردن گلیکوپروتئین ها و غیر فعال کردن RNase ها و DNase ها است. سایر مواد دناتوره‌کننده مانند اوره و نمک‌های گوانیدینیم نیز برای مختل کردن سلول‌ها و غیرفعال کردن آنزیم‌های سلولی استفاده می شوند.

مراحل مشترک در استخراج DNA از نمونه های مختلف:

• از بین بردن غشای سلولی یا لیز کردن سلول ها:

در این مرحله از روش های فیزیکی و شیمیایی برای لیز سلول استفاده می شود. عمدتا بافرهای لیز کننده حاوی دترجنت های یونی و غیر یونی هم چون SDS ,Triton X100 ,NP-40 و… به منظور لیز سلول و کمک به از بین بردن پروتئین های غشاء و پروتئين هاي متصل به DNA و هم چنین موادی مانند Tris-HCl و EDTA به منظور تنظیم اسیدیته و اسمولاریته لازم برای لیز، می باشند.

• جداکردن DNA از سایر اجزای سلولی و خالص سازی DNA:

در این مرحله از موادی هم چون فنل و کلروفرم که با ایجاد شیب چگالی باعث ایجاد چندین فاز آبی، پروتئین ها و فاز آلی استفاده می شود. در نهایت پس از سانتریفیوژ باعث رسوب پروتیئن خواهند شد می توان استفاده کرد ولی در صورتی که مقدار پروتئین عصاره سلولی بسیار بالا باشد بهتر است از آنزیم های تجزیه کننده پروتئین ها(پروتئیناز K) و هم چنین به طور اختیاری جهت از بین بردن کامل RNA می توان از RNase استفاده کرد.

• تغلیظ DNA :

تغلیظ به معنای بالا بردن غلظت DNA در حجم محلول است که برای این کار از اتانول 96% و ایزوپروپانل سرد استفاده می شود در این مرحله کلاف DNA مشاهده می شود.

• شست و شو:

در این مرحله از اتانول 70% برای جداسازی نمک ها از رسوب DNA استفاده می شود ولی باید مدتی بماند که اتانول کاملا از رسوب حذف شود چون مهار کننده ی PCR می باشد و در نهایت رسوب در آب مقطر دو بار تقطیر و یا TE حل می شود.

روشهای استخراج DNA

• روشهای فیزیکی: روش‌های فیزیکی استخراج DNA شامل خرد کردن نمونه برای تخریب دیواره سلولی یا بافت های سخت است. این یک روش متداول انجماد و آسیاب کردن نمونه ها با هاون در زیر نیتروژن مایع است تا یک ماده پودری تهیه شود و پس از آن در معرض شرایط لیز شیمیایی یا آنزیمی قرار می گیرند. روش های فیزیکی اغلب با مواد ورودی ساختار یافته مانند بافت ها یا گیاهان استفاده می شوند.

• روشهای شیمیایی: روش‌های شیمیایی را می‌توان به تنهایی با موادی که به آسانی لیز می‌شوند، مانند سلول‌های کشت در بافت یا در ترکیب با روش‌های دیگر استفاده کرد. از هم گسیختگی سلولی با عوامل مختلفی که غشاهای سلولی را از بین می برند و پروتئین ها را دناتوره می کنند، انجام می شود. مواد شیمیایی که معمولاً مورد استفاده قرار می‌گیرند شامل مواد شوینده(مانند SDS) و چائوتروپ‌ها (مانند نمک‌های گوانیدین و محلول‌های قلیایی) هستند. 

روشهای فیزیکی استخراج DNA

• استخراج DNA به روش دانه های مغناطیسی(Magnetic Bead DNA Extraction)

دانه های مغناطیسی(یا ذرات سوپر پارامغناطیس) ابزارهای کوچک همه کاره ای برای جداسازی آسان و موثر مولکول های زیستی هستند.

دانه های مغناطیسی چیست و چه کاربردی دارند؟ دانه های مغناطیسی از ذرات ریز (20 تا 30 نانومتر) اکسیدهای آهن مانند مگنتیت (Fe3O4) تشکیل شده اند که به آنها خاصیت سوپرپارامغناطیس می دهد. دانه های سوپرپارامغناطیس(super paramagnetic) متفاوت از فرومغناطیس های رایج هستند، زیرا آنها رفتار مغناطیسی را فقط در حضور یک میدان مغناطیسی خارجی از خود نشان می‌دهند.

این ویژگی به اندازه کوچک ذرات موجود در مهره ها بستگی دارد و این امکان را فراهم می کند که دانه ها به همراه هر چیزی که به آن متصل می شوند به صورت معلق از هم جدا شوند. از آنجایی که آنها خارج از میدان مغناطیسی یکدیگر را جذب نمی کنند.

مهره های مغناطیسی انواع مختلفی دارد. پوشش‌های سطحی و مواد شیمیایی مختلف به هر نوع مهره، خاصیت اتصال خاص خود را می‌دهند که می‌توان از آن برای جداسازی مغناطیسی (جداسازی و خالص‌سازی) اسیدهای نوکلئیک، پروتئین‌ها یا سایر مولکول‌های زیستی به روشی آسان، مؤثر و مقیاس‌پذیر استفاده کرد.

این سهولت استفاده، آنها را به صورت خودکار و مناسب برای طیف وسیعی از آزمایش های کاربردی ، از جمله آماده سازی نمونه برای توالی یابی نسل بعدی(NGS) و PCR، خالص سازی پروتئین، تشخیص مولکولی و ایمنی و حتی مرتب سازی سلول های فعال مغناطیسی (MACS) در میان بسیاری دیگر مناسب می کند. آنها همچنین برخی از چالش های مرتبط با استخراج اسیدهای نوکلئیک از انواع مختلف نمونه را کاهش می دهند.

• magnetic bead-based DNA extraction using Sera-Mag beads

جداسازی مغناطیسی چیست؟

جداسازی مغناطیسی از یک میدان مغناطیسی برای جدا کردن ذرات پارامغناطیس به اندازه میکرومتر از یک سوسپانسیون استفاده می کند. در زیست‌شناسی مولکولی، دانه‌های مغناطیسی روشی ساده و قابل اعتماد برای خالص‌سازی انواع مختلف مولکول‌های زیستی از جمله DNA ژنومی، پلاسمیدها، DNA میتوکندری، RNA و پروتئین‌ها ارائه می‌کنند.

به عنوان مثال، تحت شرایط بهینه، DNA به طور انتخابی به سطح مهره ای با پوشش مناسب متصل می شود و آلاینده ها را در محلول قرار می دهد. سپس می توانید از این DNA خالص شده به طور مستقیم در برنامه های زیست شناسی مولکولی استفاده کنید .

یک مزیت کلیدی برای استفاده از دانه های مغناطیسی این است که می توانید اسیدهای نوکلئیک و سایر مولکول های زیستی را مستقیماً از یک نمونه خام و از انواع مختلف نمونه با حداقل پردازش جدا کنید. این روش دانه‌های مغناطیسی را از سایر روش‌های جداسازی اسید نوکلئیک، که ممکن است پروتکل‌های متفاوتی برای انواع مختلف نمونه داشته باشند، متمایز می‌کنند بعلاوه و زمان بیشتری برای انجام آزمایش را در بر می‌گیرد.

• استخراج DNA با استفاده از دستگاه مبتنی بر کاغذ (Paper DNA Extraction)

Paper DNA Extraction یک روش ساده، کم هزینه و ایمن با استفاده از صفحات چرخشی 96 چاهکی مبتنی بر کاغذ فیلتردار و محلول‌های خانگی برای استخراج DNA با بازدهی بالا برای استفاده در تجزیه و تحلیل نشانگر مولکولی است.

پیچیدگی روش های فعلی جداسازی اسید نوکلئیک استفاده از آنها را در خارج از محیط آزمایشگاهی مدرن و فعلی محدود می سازد. در اینجا، ما یک روش سریع و مقرون ‌به‌صرفه برای خالص‌سازی اسیدهای نوکلئیک از نمونه‌های حیوانی، گیاهی، ویروسی و میکروبی با استفاده از یک پایه سلولزی توصیف می‌کنیم. اسیدهای نوکلئیک را می توان با فرو بردن در خانه های ساخته شده  تنها در سه محلول خالص کرد:

– عصاره (برای اتصال اسیدهای نوکلئیک)

– بافر شستشو (برای حذف ناخالصی ها)

– واکنش تقویت (برای شستشوی اسیدهای نوکلئیک).

سرعت و سادگی این روش، آن را برای کاربردهای مولکولی، چه در داخل و چه در خارج از آزمایشگاه، از جمله تنظیمات با منابع محدود مانند سایت‌های میدانی از راه دور و موسسات آموزشی، ایده‌آل می‌سازد. با استفاده از دستورالعمل‌ها، می‌توان استخراج اسید نوکلئیک مبتنی بر دیپ استیک را در 30 ثانیه انجام داد.

روش های شیمیایی استخراج DNA:

• روش استخراج Organic DNA:

روش فنل کلروفورم

یکی از بهترین و رایج ترین روشهای جداسازی DNA، فنل-کلروفرم است که توسط بارکر در سال 1998 بوجود آمد. در این تکنیک ابتدا بافت مورد نظر با محلول خاصی به نام بافر لیز مانند(سدیم دودسیل سولفات) SDS لیز و پروتئیناز K برای هضم آنزیمی پروتئین ها و اجزای سلولی اسید غیرنوکلئیک استفاده می شود. اجزای بافر لیز نقش کمک کننده ای در تخریب غشای سلول و همچنین تخریب غشای هسته ایفا می کنند. بخش پروتئینی سلول با کمک کلروفرم و فنل که از دسته ترکیبات آلی هستند، دناتوره می شود.

در مورد روش فنل کلروفرم بیشتر بخوانید.

• روش های استخراج Inorganic DNA:

روش استخراج DNA با استفاده از پروتئیناز-کا (Proteinase K DNA extraction)

پروتئیناز K یکی از بهترین روش‌های استخراج DNA تا به امروز است. روشی دقیق، قابل اعتماد و سریع است. روش استخراج DNA پروتئیناز K به دلیل نقش مهم آنزیم پروتئیناز K در استخراج DNA به عنوان یک روش آنزیمی استخراج DNA نیز نامیده می شود.

تیمارهای آنزیمی می‌توانند برای پردازش با راندمان بالا قابل قبول باشند، اما ممکن است در مقایسه با سایر روش‌های اختلال هزینه هر نمونه بالاتری داشته باشند.

بخش عمده سلول از پروتئین تشکیل شده است. غشای هسته ای، آنزیم ها، لیگاندها، گیرنده ها، چاپرون ها، آنتی بادی ها و سایر افسانه های خاص گیرنده تنها پروتئین هستند. همچنین غشای سلولی و غشای هسته ای از پروتئین های مرکب مانند فسفولیپید، گلیکوپروتئین و اسفنگومیلین تشکیل شده است. اینها چندین مولکول هستند که از پروتئین ها به همراه برخی لیپیدها، کربوهیدرات ها و سایر مولکول ها تشکیل شده اند.

پروتئیناز K بخش پروتئینی این مولکول ها را هضم می کند. علاوه بر این، پروتئین مرتبط با DNA را هضم می کند. این پروتئین از زنجیره طولانی اسیدهای آمینه تشکیل شده است. بسته به ماهیت تعامل آنها با آب، آن را به اسیدهای آمینه آبدوست (جذب آب) و آبگریز (دفع آب) تقسیم می کنند.

پروتئیناز K عمدتاً اسیدهای آمینه آبگریز (هم معطر و هم آلیفاتیک) را هضم می کند. کوفاکتور، یون کلسیم، ثبات آنزیم را فراهم می کند، با این حال، نمی تواند فعالیت واکنش را افزایش دهد.

با این حال، استفاده از پروتئیناز K در مقایسه با سایر معرف‌های مورد استفاده در روش‌های مختلف مبتنی بر محلول می‌تواند زمان‌بر و پرهزینه باشد، بنابراین تلاش برای یافتن معرف‌های جایگزین به منظور پروتئین زدایی DNA صورت گرفته است.

در مورد روش استخراج با پروتئیناز-K بیشتر بخوانید.

روش استخراج DNA بر پایه نمک(Salting out Method)

یکی از روش های متداول برای استخراج DNA استفاده از نمک های اشباع می باشد. همه سلول هاي هسته دار DNA دارند. در بافت هایی مثل خون فقط گلبول هاي سفيد DNA دارند و گلبول های قرمز DNA ندارند، پس در ابتدا باید از شر گلبول های قرمز خلاص شوید .

به این منظور، مقداری خون را در تیوب ریخته و تقریبا دو برابر حجم خون آب مقطر سرد به آن اضافه نمائید پدیده اسمز در گلبول‌های قرمز باعث می شود مولکول‌های آب از جداره ی نیمه تراوای گلبول قرمز عبور کرده و به درون گلبول قرمز راه ‌یابند، در نتیجه مقدار آب درون گلبول رفته رفته افزایش یافته تورژسانس رخ می دهد و منجر به پاره شدن جداره ی سلول خونی و لیز آن می شود.

در مورد روش استخراج بر پایه نمک بیشتر بخوانید.

روش استخراج DNA بر پایه سیلیکا ژل(Silica Gel Based DNA Extraction)

در روش‌های خالص‌سازی اسید نوکلئیک مبتنی بر سیلیکا از یک فرآیند ساده اتصال-شستشو-شوینده استفاده می‌شود. اسیدهای نوکلئیک در حضور نمک های chaotropic به غشای سیلیس متصل می شوند. پلی ساکاریدها و پروتئین ها به خوبی به ستون متصل نمی شوند و آثار باقی مانده در طی مراحل شستشوی مبتنی بر الکل همراه با نمک ها حذف می شوند. پس از اتصال و شستشو، اسیدهای نوکلئیک به طور انتخابی تحت شرایط کم نمک، با استفاده از آب یا بافر TE شسته می شوند. روش های مبتنی بر سیلیس سریع، آسان و مقرون به صرفه هستند.

جذب اسیدهای نوکلئیک به سطح شیشه یا سیلیس در حضور غلظت‌های بالایی از نمک‌های chaotropic ابتدا توسط Vogelstein و Gillespie توصیف شد که قطعات DNA را از ژل‌های آگارز با استفاده از پودر شیشه بازیابی کردند. این فناوری اکنون بیشتر توسعه یافته است و پروتکل های لیز کارآمد برای انواع مواد اولیه پیچیده ایجاد شده است.

اتصال انتخابی DNA یا RNA از طریق استفاده از سطوح سیلیکاژل اصلاح شده و بافرهای اتصال و شستشو بهینه شده است تا حداکثر تمایز بین اسیدهای نوکلئیک را امکان پذیر سازد. پس از لیز ماده اولیه، نمونه تنظیم می شود تا اتصال اسید نوکلئیک مورد نظر به غشاء را تقویت کند. پلی ساکاریدها و پروتئین ها متصل نمی شوند و حذف می شوند. اسید نوکلئیک متصل شده با بافرهای حاوی الکل برای نمک زدایی شسته می شود.

برای دریافت خدمات مربوط به استخراج DNA از انواع نمونه ها

از طریق لینک خدمات آزمایشگاهی می توانید اقدام نمایید