توالی یابی سنگر، تکنیکی به منظور تعیین ترتیب دقیق بازها در نوکلئیک اسیدها
توالی یابی سنگر(Sanger) زیربنای همه تکنولوژی های توالی یابی است که هم اکنون مورد استفاده قرار می‌گیرند و ژنومیکس (علم مطالعه ژنوم) را شکل داده است.
تاریخچه توالی یابی DNA
اولین توالی های DNA در اوایل دهه 1970 توسط محققان با استفاده از روش های پر زحمت مبتنی بر کروماتوگرافی دو بعدی بدست آمد. به دنبال توسعه روش های توالی یابی مبتنی بر فلورسانس با یک توالی سنجی DNA، تعیین توالی DNA آسان تر و سریعتر شده است.
توالی یابی DNA فرآیند تعیین توالی اسید نوکلئیک – ترتیب نوکلئوتیدها در DNA است. این تکنیک شامل هر روش یا فناوری است که برای تعیین ترتیب باز های الی موجود در ژنوم استفاده می شود که عبارت است از: آدنین، گوانین، سیتوزین و تیمین( (A,T,C,G) می باشد. ظهور روش های توالی یابی سریع DNA، تحقیقات و کشف بیولوژیکی و پزشکی را بسیار تسریع کرده است.
تکنیک توالی یابی DNA برای تحقیقات بیولوژیکی پایه، پروژه های ژنوگرافی DNA و کاربردهای در زمینه های متعددی مانند تشخیص پزشکی، بیوتکنولوژی، زیست شناسی قانونی، ویروس شناسی و سیستماتیک بیولوژیکی ضروری شده است. مقایسه توالی های DNA سالم و جهش یافته می تواند بیماری های مختلف از جمله سرطان های مختلف را تشخیص دهد، مجموعه آنتی بادی را مشخص کند و می تواند برای هدایت درمان بیمار استفاده شود. داشتن یک راه سریع برای توالییابی DNA، امکان انجام مراقبت‌های پزشکی سریعتر و فردی‌تر را فراهم می‌کند و ارگانیسم‌های بیشتری را شناسایی و فهرست‌بندی می‌کند.
سرعت بالای توالی یابی به دست آمده با فناوری مدرن توالی یابی DNA در تعیین توالی، توالی های کامل DNA یا ژنوم و گونه های متعدد حیات، از جمله ژنوم انسان و سایر توالی های DNA کامل بسیاری از حیوانات، گیاهان و میکروب ها موثر بوده است.
در تکنیک توالی یابی سنگر (Sanger) مولکول های DNA تک رشته ای که فقط در حد یک نوکلئوتید با هم تفاوت دارند، می توانند توسط الکتروفورز در ژل پلی آکریل آمید حاوی اوره به عنوان ترکیب دناتوره کننده و یا سایر ترکیبات دناتوره کننده که باعث می شود DNA به صورت تک رشته ای باقی بماند با ولتاژ بالا از یکدیگر جدا شوند.
ایجاد کتابخانه های DNA، پایه تکنیک های توالی یابی ژنوم بود و انجام آن را ممکن ساخت. فردریک سنگر (Frederick Sanger) که یک زیست شیمیدان انگلیسی بود در سال ۱۹۷۴ تکنیکی را جهت تعیین توالی ژن ها در محیط in vitro ابداع کرد که تاکنون بیشتر از همه مورد استفاده قرار گرفته است، این تکینک توالی یابی Sanger نام گرفت که به روش خاتمه زنجیره سازی یا روش دی داکسی نیز معروف است و اساس آن آنزیمی می‌باشد.
توالی یابی Sanger زیربنای همه تکنولوژي‌های توالی یابی است که هم اکنون مورد استفاده قرار می‌گیرند و ژنومیکس (علم مطالعه ژنوم) را شکل داده است. جهت تعیین توالی ژنوم‌های فراوانی مانند E. coli، مگس سرکه، کرم‌های نواری (نماتودها)، موش و انسان از تکنیک توالی یابی sanger استفاده شده است.
توالی یابی سنگر (Sanger) مثل فرایند تکثیر DNA و تکنیک PCR به پرایمر، DNA پلیمراز، توالی الگوی تک‌رشته‌ای و دئوکسی نوکلئوتیدها نیاز دارد. در ابتدا سوبسترای واکنش عمدتا DNA نوترکیبی بود که به وسیله دناتوراسیون می توانست به پرایمر توالییابی اختصاصی رشته متصل شود. قطعات DNA در وکتورهای فاژمیدی هم چون وکتور M13 که در اثر دستکاری می‌توانستند DNAهای نوترکیب تک‌رشته‌ای تولید کنند، نیز کلون می‌شدند.
روش جایگزینی که امروزه نیز کاربرد فراوانی دارد ایجاد DNA تک رشته ای از طریق تعیین توالی چرخه(Cycle sequencing) یا تعیین توالی تکثیر خطی است که در این حالت روند کار شبیه PCR است ولی فقط از یک پرایمر استفاده می شود که همین امر سبب می شود که محصول PCR به صورت خطی (و نه تصاعدی) افزایش یابد و پلیمراز مورد استفاده هم نباید دارای خاصیت proofreading باشد تا سرعت الحاق نوکلئوتیدها افزایش پیدا کند.
در تکنیک توالی یابی سنگر، درصد معینی از نوکلئوتیدها که فاقد 3OH-هیدروکسیل هستند و دی دئوکسی نوکلئوتید (Dideoxynucleotide: ddNTP) نامیده می‌شوند که با دئوکسی نوکلئوتیدهای نرمال مخلوط می‌شوند. آنزیم‌های پلیمراز نمی توانند دئوکسی نوکلئوتیدها را از دی دئوکسی نوکلئوتیدها افتراق دهند.
DNA پلیمراز افزودن نوکلئوتید بعدی را با اتصال فسفات روی کربن ۵َ آن، به کربن شماره 3 دارای OH- نوکلئوتید پیشین و با تشکیل پیوند فسفودی‌استر انجام می‌دهد پس در صورتی که یکی از نوکلئوتیدها فاقد گروه OH (هیدروکسیل) بر روی کربن شماره 3 باشد، نوکلئوتید دیگری اضافه نخواهد شد و زنجیره به طور ناگهانی خاتمه می یابد. نسبت دئوکسی ریبونوکلئوتیدها بسیار بالاتر از دی دئوکسی ریبونوکلئوتیدهاست، به همین دلیل خاتمه سنتز زنجیره جدید در نزدیکی پرایمر اتفاق نمی افتد.
این امکان وجود دارد که پلیمریزاسیون چند صد نوکلئوتید، پیش از آن که باز خاتمه دهنده رشته اضافه شود رخ دهد. در چنین واکنش‌هایی عمدتا حداکثر طول قطعات ۸۰۰ نوکلئوتید خواهد بود. چهار واکنش جداگانه برای ddTTP، ddGTP، ddCTP، ddATP انجام می شود ( در هر واکنش یکی از نوکلئوتیدهای طبیعی از نوع نشاندار رادیواکتیو استفاده می شود).
در تکنیک توالی یابی Sanger مولکول‌های DNA تک‌رشته ای که فقط در حد یک نوکلئوتید با هم تفاوت دارند، می توانند توسط الکتروفورز در ژل پلی آکریل آمید حاوی اوره به عنوان ترکیب دناتوره کننده و یا سایر ترکیبات دناتوره کننده که باعث می شود DNA به صورت تک رشته ای باقی بماند با ولتاژ بالا از یکدیگر جدا شوند.
از اتورادیوگرافی جهت رؤیت نتیجه استفاده می کنند. خواندن اتورادیوگرام از سمت پایین ژل به بالا صورت می گیرد و در این حالت توالی های به دست آمده مکمل توالی اصلی می باشند.
داده ها نیز به صورت دستی وارد کامپیوتر می‌شوند. به همین دلیل این پروسه بسیار طولانی است، ۱۲ ساعت برای الکتروفورز، ۱۲ ساعت برای ایجاد اتورادیوگرام و مدت زمان بسیار طولانی تری برای خواندن توالی‌ها موردنیاز است. هم چنین احتمال وقوع اشتباه نیز بالا و استفاده از بازهای لیبل شده با مواد رادیواکتیو خطرناک است به همین دلیل از تعیین توالی سنگر به روش اتومات استفاده می شود که کارآیی آن را افزایش می دهد. در این روش توالی های تا 400 نوکلئوتید را می توان تعیین کرد.
تعیین توالی سنگر به روش اتومات؛ حل مشکل زمان بر بودن و بالا بودن احتمال وقوع اشتباه تعیین توالی سنگر
با توجه به آن چه گفته شد انجام برخی اصلاحات الزامی بودند به خصوص اگر قصد ما از توالی یابی، ژنوم های بزرگی مثل ژنوم انسان بود. به همین منظور در اوایل دهه 1990 ماشین های توالی یابی اتوماتیک به صورت تجاری به بازار عرضه شدند که هم سریع تر بودند و هم احتمال خطا در آن ها به مراتب کم تر شد. اگر چه هزینه راه اندازی این تکنیک به دلیل گران بودن دستگاه آنالیز کننده توالی بسیار بالاست ولی از آنجایی که آنالیز چندین نمونه به صورت هم زمان است در نهایت هزینه توالی یابی هر نمونه بسیار پایین است.
در این نوع توالی یابی، مخلوط واکنش دارای ۴ نوع دئوکسی نوکلئوتید نرمال، ۴ نوع دی دئوکسی نوکلئوتید، یک پرایمر، DNA الگو و DNA پلیمراز می‌باشد که جهت جداسازی دی دئوکسی نوکلئوتیدها از هم، از چهار رنگ فلورسنت متفاوت به عنوان لیبل برای هر یک از چهار واکنش اختصاصی باز استفاده می شوند که با استفاده از رنگ هایی که طول موج نشری متفاوت دارند، می‌توان هر چهار واکنش را به صورت یک نمونه در چاهک ژل وارد کرد.
مراحل انجام واکنش دقیقا همانند PCR معمولی است که تکثیر در دستگاه Thermal cycler انجام می گیرد. در هنگام پلیمریزاسیون، این امکان وجود دارد که دی دئوکسی نوکلئوتیدها متصل شده و زنجیره DNA خاتمه یابد.نسبت دی دئوکسی نوکلئوتیدها به دئوکسی نوکلئوتیدها باید طوری باشد که توقف همانندسازی حتما در هر کدام از بازهای A، G، T و C صورت بگیرد.
بعد از آن که پلیمراز از توالی الگو هزاران نسخه که هر کدام در نوکلئوتید متفاوتی خاتمه پیدا کردند، تهیه کرد، تمام مخلوط واکنش در یک ستون الکتروفورز می شود که قطعات DNA از منبع تحریکی همانند لیزر عبور می‌کنند. در این هنگام، هم زمان با عبور قطعات DNA از نقطه‌ای مشخص در ژل، سیگنال‌های فلورسنت شناسایی و ضبط می‌شوند. در نهایت، یک intensity profile برای هر یک از فلوروفورها ایجاد می شود که در آن، هر یک از چهار رنگ باز متفاوتی را نشان می دهند. هم زمان اطلاعات به طور الکترونیکی ذخیره می‌شوند.
ابتدا از ژل slab پلی آکریل آمید برای این منظور استفاده می‌کردند، ولی با توالی یابی capillary که نمونه‌های DNA از طریق لوله‌های شیشه‌ای موئین بلند و بسیار نازکی که قطرشان در حدود 0/1 میلی‌متر است و دارای ژل پلی آکریل آمید هستند، الکتروفورز می‌شوند، می توان ظرفیت فرایند توالی یابی DNA را به میزان زیادی افزایش داد.
بیشتر یاد بگیرید!
