اصول و کاربرد طراحی پرایمر در آزمایشگاه
پرایمر یک توالی DNA کوتاه و تک رشته ای است. یا به عبارت دیگر پرایمر رشته کوتاهی از جنس اسیدنوکلئیک (RNAیا DNA) است که معمولا از ۱۸ تا ۲4 باز آلی تشکیل شده است. این رشته کوتاه به عنوان نقطهای برای آغاز سنتز DNA عمل میکند. در موجودات زنده، آغازگرها رشته های کوتاه RNA هستند.در واقع پرایمرها الیگونوکلئوتیدهایی هستند که در PCR مکمل رشته الگو DNA می باشند.
اولین مرحله برای انجام تکنیک واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) پس از تعیین ژن ها طراحی پرایمر است. در تکنیک PCR، از یک جفت پرایمر برای هیبریداسیون با DNA نمونه و تعیین ناحیه ای از DNA که تکثیر می شود، مورد استفاده قرار می گیرد.. به پرایمرها الیگونوکلئوتید نیز گفته می شود. بنابراین طراحی پرایمر مناسب برای واکنش های موفق PCR ضروری است و یک عامل کلیدی با عملکرد بالا به شمار می رود.
تاریخچه طراحی پرایمر
طراحی پرایمر در سال 2005 توسط دکتر جیم ویکس(Jim Wicks)، دکتر راب پاول ( Rob Powell ) و پروفسور تام براون (Tom Brown within)در دانشگاه ساوت همپتون (Southampton) با هدف تمرکز بر PCR و شیمی DNA طراحی شد. این شرکت از آن زمان تاکنون رشد کرده است و محصولات آن در بیش از 100 کشور مورداستفاده قرار گرفته است.
پرایمر توسط آنزیمی به نام پریماز که نوعی RNA پلیمراز است سنتز می شود. پرایمر در فرآیند سنتز DNA ضروری است زیرا آنزیمهای DNA پلیمراز که DNA را سنتز میکنند، فقط میتوانند نوکلئوتیدهای DNA جدید را به یک رشته از جنس DNA متصل کنند. بنابراین پرایمر به عنوان پرایم کردن و ایجاد پایه ای برای سنتز DNA عمل می کند.
پرایمرها پیش از تکمیل تکثیر DNA حذف می شوند و شکاف های توالی با DNA توسط DNA پلیمرازها پر می شوند. در آزمایشگاه، دانشمندان میتوانند آغازگرهای DNA را با توالیهای خاصی طراحی و سنتز کنند که به توالیهای یک مولکول DNA تک رشتهای متصل میشوند. این پرایمرهای DNA معمولاً برای انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز برای کپی کردن قطعات DNA یا برای تعیین توالی DNA استفاده می شوند.
پرایمر، در واکنش PCR شرکت میکند و سر 3 هیدروکسیل آزاد را در اختیار «آنزیم Taq پلیمراز» قرار میدهد. و یکی از مراحل ضروری و حساس در بسیاری از تحقیقات ژنتیکی است. میدانیم که در ژنوم موجودات پیچیدهای مانند انسان، در هر ناحیه، تنها یکی از دو رشته DNA به عنوان ژن فعال، عمل میکند. معمولا هدف از انجام PCR، تکثیر این ناحیه است و به آن «ناحیه هدف» (Target Region) میگوییم. برای این کار به دو پرایمر نیاز است که یکی به رشته هدف و دیگری به رشته مکمل آن متصل میشود.
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) یکی از مهم ترین اختراعات قرن بیستم در زیست شناسی مولکولی به شمار می آید که به کمک آن می توان مقدار کمی از ماده ژنتیکی را تکثیرکردبه منظور شناسایی، دستکاری DNA، تشخیص تغییرات ژنتیکی مانند جهش و … را انجام داد.
مراحل یک سیکل PCR
- مرحله واسرشت یا دناتوراسیون (Denaturation Step)
- مرحله اتصال (Annealing Step):
- مرحله پليمريزاسيون یا طویل شدن (Extension/Elongation Step):
- مرحله طویل شدن نهایی (Final Elongation)
محصول نهایی PCR به سه عامل بستگی دارد:
- DNA الگو یا Template
- شرایط و مواد واکنش
- طراحی پرایمر
کاربرد طراحی پرایمر
طراحی پرایمرِ مناسب برای واکنش های موفق PCR ضروری است و یک عامل کلیدی با عملکرد بالا به شمار می رود.
برای PCR لازم است که 2 پرایمر Forward و Reverse طراحی کنیم. پرایمر Forward از ابتدای قسمت´5 به´3 و پرایمر Reverse از ابتدای´3 به ´5 طراحی می شود.
اتصال پرایمرها به مولکول الگو یا DNA template با پیوند هیدروژنی صورت می گیرد. پرایمر Forward یا پیشرو به رشته آنتی سنس متصل می شود و پرایمر Reverse یا پیرو به رشته DNA مقابل یا رشته سنس متصل می شود و توالی آن مکمل رشته هدف یا ژن مورد نظر است.
شرایط و مراحل طراحی پرایمر:
-
طول پرایمر و محصول
اولین و مهمترین نکته در طراحی پرایمر به آن توجه کنیم، طول پرایمر است.
برای انجام یک PCR اختصاصی بهتر است طول پرایمرهای طراحی شده پروتکل های طراحی پرایمر 24-18 نوکلئوتید در نظر گرفته شود، که در این بازه افزایش هر نوکلئوتید باعث تقویت 4 برابری اختصاصیت پرایمر می شود. پرایمر با طول بلندتر احتمال تشکیل ساختارهای ثانویه را بیشتر می سازد و پرایمر باطول کمتر، اختصاصیت اتصال به یک ژن را کمتر؛ و نیز انتخاب دمای اتصال را سخت تر می کند پس نتیجه می گیریم که پرایمر از طول مناسبی برخوردار باشد، باعث افزایش اختصاصیت آن و همچنین تغییر دمای مرحله annealing می شود.
پرایمرهای با طول کمتر از 15 نوکلئوتید بسیار غیر اختصاصی هستندو ممکن است به چندین نقطه از ژن متصل شوند و این موضوع باعث ایجاد باندهای غیر اختصاصی ر ژل الکتروفورز می شود. در نتیجه علاوه بر محصول خودمان، محصول غیر اختصاصی نیز بدست می آید.
افزایش طول پرایمر نیز باعث افزایش دمای مرحله annealing در PCR می شود و زمان آن را طولانی تر می کند و احتمال تشکیل ساختارهای ثانویه و دایمرها را افزایش می دهد. بنابراین بهتر است که از یک بازه استاندارد که بین 30-18نوکلئوتید است برای طراحی پرایمر استفاده کنیم.
برای اتصال پرایمرهای باطول کمتر از 10 نوکلئوتید نیاز به پروتئین های خاصی است که بتوانند اتصال بین پرایمر و رشته الگو را محکم کنند. پرایمرهای طراحی شده که قطعه ی نوکلئوتیدی کوچکتر از 200bp دارند،واجد کارایی و بازدهی بهتری نسبت به پرایمرهایی با که قطعه ی نوکلئوتیدی بلندتر از 3kbp هستند. حداکثر طول قطعه ی سنتزشده با استفاده از پروتکل ¹long and accurode PCR ، طولی برابر با 40kbp است.
به طور بهینه برای انجام روشهای کمی Qpcr اندازه قطعه هدف حدود 100bpوبرای PCR استاندارد اندازه ی قطعه نزدیک به 500bp مناسب است. اگر موقعیت هر کدام از پرایمرهایتان را بدانید، با محاسبه ی موقعیت پرایمر سنس(Forward) منهای موقعیت پرایمر آنتی سنس(Reverse) به اضافه عدد 1 میتوانید طول محصول خود را محاسبه کنید.
فرمول: Forward – Reverse + 1= طول محصول
-
Tmپرایمر
دومین نکته در طراحی پرایمر درجه حرارت ذوب مولکول DNA یا Tm است.
Tm به دمایی گفته می شود که در آن نیمی از DNAهای دو رشته از هم جدا می شوند و به صورت تک رشته در می آیند، در واقع نیمی از بازها با مکمل خود بر روی رشته ی مقابل درحالت جفت شدگی نیستند، اما پرایمرهایی که به صورت تک رشته ساخته می شوند، ممکن است در دمای پایین نیز تشکیل دایمر داده باشند. پس دمای TMبرای جدا شدن پرایمرها هم از اهمیت ویژه ای برخوردار است.
برای بیشتر DNAهای طبیعی این اتفاق در دمای 70-1000Cمی افتد. البته این دمای ذوب به طول رشته ی DNA و میزان محتوی GC نیز بستگی دارد و همچنین عواملی مانند یون منیزیم و غلظت های نمکی بالا با خنثی سازی بارهای منفی گروه های فسفات رشته DNA باعث پایداری DNA دو رشته ای مارپیچ شوند، عواملی مانند PH بالا و غلظت نمکی پایین نیز باعث کاهش پایداری DNA دو رشته ای مارپیچ می شوند.
به عبارت دیگر؛ Tm پرایمر به دمای ذوبی گفته می شود که در آن محدوده ی اتصال پرایمر و الگو پایدار می باشد، که رِنجی بین 45-65 0 C دارد. به طور کلی میزان Tm واقعی پرایمر را 5+ و 5- درجه بالا و پایین تر از Tm محاسبه شده درنظر می گیرند.
دمای Tm بهینه پرایمر براساس سیکل های معمول، شرایط واکنش و دمای بهینه مورد نیاز برای انجام واکنش معمول بین
60-640 C می باشد که دمای ایده آل آن 620C است.
Tmبالاتر از دمای بالاتر از 650C، باعث تمایل پرایمر به اتصال و دمای اتصال غیر اختصاصی می گردد. همچنین اختلاف Tm هرکدام از رشته های پرایمر بالا و پایین نیز نباید بیشتر از 5 درجه با هم اختلاف داشته باشند. این اختلاف دمایی هر چقدر کمتر باشد( شرایط ایده آل کمتر از 2 درجه برای اتصال همزمان و افزایش بازده تولید قطعه ی PCR (، راه اندازی واکنش PCR راحت تر خواهدبود. مرحله اتصال پرایمر متغیرترین مرحله PCR است، شرایطی مثل دمای پایین اتصال، طراحی اشتباه پرایمر، میزان بالای آنزیم پلی مراز می تواند باعث اتصال غیراختصاصی پرایمر شود.
برای بدست آوردن Tm پرایمرهای با طول کمتر از 14باز از فرمول Tm= 2(XT + wA) +4( yG + zC)
و برای پرایمرهایی با طول بیشتر از فرمول Tm= 64.9+41(yG +zC -16.9) /(xT + wA +Zc) استفاده می شود.
نکته: در فرمول، y،z،x،wبه ترتیب G،C،T، Aمی باشد. اگر در توالی پرایمر خود نوکلئوتید دژنره B،H،V،D،M،K،S،W،R،Y،N دارید، باید پیش از محاسبه ی Tm آن ها را جایگزین کنید.
پرایمر : Forward پرایمر بالا یا Forwardیا سنس، به صورت قراردادی به پرایمری که به نزدیکترین کدون آغاز ژن هدف متصل می شود می گویند.
پرایمر : Reverse پرایمر پایین یا Reverseیا آنتی سنس، به صورت قراردادی به پرایمری که به نزدیکترین کدون پایان ژن هدف متصل می شود می گویند.
TM به دمایی گفته می شود که در آن نیمی از DNAهای دو رشته از هم جدا می شوند و به صورت تک رشته در می آیند، اما پرایمرهایی که به صورت تک رشته ساخته می شوند، ممکن است در دمای پایین نیز تشکیل دایمر داده باشند. پس دمای TMبرای جدا شدن پرایمرها هم از اهمیت ویژه ای برخوردار است. معمولا دمای annealing را 2 تا 4 درجه سانتی گراد کمتر از دمای ذوب یا TM درنظر می گیرند.
پرایمرهای Forward و Reverseدر صورت داشتن TMهای یکسان یا شبیه به هم، اتصال بهDNA الگو در آنها بطور همزمان صورت می گیرد.
معمولا به طور استاندارد تعریف شده است که پرایمرهای با دمای ذوب در محدوده 52-58 درجه سانتی گراد، معمولا بهترین نتیجه را در پی دارند.
یک نکته ای که مهم است و باید حتما رعایت کنیم این است که TM پرایمر از TM رشته الگو کمی بیشتر باشد، چون زمانی که دوتا رشته از همدیگر جدا شدند یک حالت رقابتی ایجاد می شود و پیش از اینکه دو رشته به هم متصل شوند پرایمرها بتوانند به رشته الگو متصل شوند و واکنش PCR به درستی انجام شود. بنابراین طراحی مناسب پرایمر برای واکنش های موفق PCR ضروری است. و یک عامل کلیدی برای انجام PCR با عملکرد بالا به شمار می رود. برای انجام PCR لازم است که 2 پرایمر Forward و Reverse طراحی کنیم. پرایمر Forward از ابتدای قسمت ´5 به ´3 و پرایمر Reverse ازابتدای قسمت ´3 به ´ 5 طراحی می شود.
محاسبه دمای TM طبق فرمول زیر محاسبه می شود:
TM of primer in 0C = [4(C+G)+ 2(A+T)]
اتصال پرایمرهابه مولکول الگو یا DNA template با پیوند هیدروژنی صورت می گیرد. پرایمر Forward یا پیشرو به آنتی سنس متصل و پرایمر Reverse یا پرایمر پیرو به رشته DNA مقابل یارشته سنس متصل می شود و توالی مکمل و معکوس رشته هدف یا ژن است.
-
Taپرایمر
زمان طراحی پرایمر این نکته حائز اهمیت است که دمای annealing در PCR به طور مستقیم با طول و ترکیب پرایمر در ارتباط است. این دما نباید بیش از 5 درجه پایین تر از دمای Tmپرایمر باشد. یکی از پیامدهای داشتن Ta پایین در یک یا هر دو رشته پرایمر این است که عدم تطابق تک بازهای داخلی پرایمر یا اتصال جزیی با توالی غیر هدف نادیده و قابل تحمل می شود، این موضوع باعث تولید امپلیکون های غیراختصاصی و در نتیجه کاهش میزان غلظت محصول مورد نظر می شود.
در مقابل اگر Taخیلی بالا باشد بازده واکنش ممکن است خیلی کاهش پیدا کند، زیرا احتمال اتصال پرایمر به طور قابل توجهی کاهش پیدا می کند. دمای بهینه Ta باعث تولید قطعات با میزان غلظت بالا از هدف مورد نظر می شود.
فرمول Rychlik برای محاسبه Ta به صورت زیر می باشد:
14/9-(محصول) Tmx .07 +(پرایمر ) Ta= .03 x Tm
نکته: Ta تحت تاثیر Tmپرایمرها و محصول قرار دارد. بالا بودن بیش از حد دمای Ta به معنی ناکارآمدی هیبریداسیون پرایمر الگوی که به تولید یک محصول با باند ضعیف در پایان PCR می شود.
از طرفی هم بیش ازحد بودن این دما باعث می شود مقدار زیادی باندهای غیر اختصاصی تولیدشود که طبق این فرمول بدست می آید:
Ta =0.3x TM (primer) + 0.7 TM (product) – 14.9 where
TM(primer) = Melting Temperature of the primer
TM(product) = Melting Temperature of the Product
-
اختصاصیت
یکی از مهمترین مباحث طراحی پرایمر، اختصاصی بودن توالی پرایمر برای هدف مورد نظر و تکثیر آن بدون اینکه پرایمر، توالی اختصاصی دیگری را هدف قرار دهد، میباشد. حتما پرایمرهای طراحی شده را از نظر اختصاصی بودن برای ژنموردنظر بررسی کنید. برای این کار از نرم افزارهای آنلاین Blast در سایت NCBI استفاده کنید.
نکته مهم دیگر در رابطه با طراحی پرایمر، پراکنش نوکلئوتیدی است. اما ترجیحا 60-50 درصد غنی از باز آلی سیتوزین و گوانین (C,G) باشد و سه باز انتهایی سر 3´ بهتر است از باز C یا G باشد زیرا این بازها اتصالات محکمتری با DNA الگو برقرار می کنند.
-
پیچیدگی توالی پرایمر
در هنگام طراحی پرایمر باید توالی از نظر ساده بودن و میزان پیچیدگی بررسی شود. توالی های ساده با نوکلئوتیدهای تکرار شونده احتمال اتصال اشتباه را بیشتر می کنند. در نتیجه DNA پلی مراز دچار خطا شود و سرخوردگی ایجاد شود و احتمالا نمی تواند 1یا 2 نوکلئوتید را بخواند و در نهایت یک تغییر frameshift ایجاد می شود.
حضور یک G یا C در 5 باز انتهایی´ 3 توالی پرایمر، با توجه به اتصال قویتر باز Gو C باعث کمک به اتصال اختصاصی تر سر´3 پرایمر با هدف می شود. از قرار گرفتن 3 باز G یا C یا بیشتر در 5 باز انتهایی´ 3 توالی پرایمر خودداری کنید. توالی پرایمر نباید شامل 4 گوانوزین یا بیشتر به صورت پشت سرهم و تکراری باشد، زیرا کارایی پرایمر در هنگام جفت شدن را پایین می آورد.
تکرار متوالی یک دی نوکلئوتید به طور اجتناب ناپذیری می تواند در طول توالی پرایمر اتفاق بیفتد و باید تا جایی که امکان دارد از آن اجتناب کرد، چون تکرارهای دی نوکلئوتیدی به عنوان مثال ATATATAT باعث اتصالات غیر اختصاصی می شود. حداکثر تکرار قابل قبول یک دی نوکلئوتید در رشته توالی 3 دی نوکلئوتید است.
-
محتوای GC پرایمر
درصد GC در طراحی پرایمر نکته بسیار مهمی است که باید مورد توجه قرار گیرد. پرایمر در DNA الگو باید مقدار سیتوزین و گوانین مشابهی داشته باشد تا در دمای annealing اتصال مناسبی بین پرایمر و DNA الگو صورت بگیرد.
در اغلب پروتکل های طراحی پرایمر درصدGC توالی پرایمر بین 35 تا 65 درصد بوده، که میزان ایده آل آن 50 درصد می باشد و باعث حفظ پیچیدگی منحصر به فرد برای توالی مورد نظر می گردد. میزان محتوی بیشتر از 65 درصد، به علت امکان ایجاد پیوند پایدار با سایر الگوهای غیر اختصاصی نوکلئوتیدی موجود در واکنش باعث اتصالات ناخواسته پرایمر می شود.
همچنینی پیوند پایدار و محکم در د صد GC بالا باعث کندی حرکت پلی مراز می شود، همچنین درصد GCبالا باعث افزایش دمای اتصال و احتمال تشکیل لوپ سنجاق سری می شود. از طرف دیگر اگر میزان GC خیلی پایین باشد، باعث تشکیل پیوندهای سست بین پرایمر والگو می گردد که بازده PCR را کاهش می دهد.
-
پایداری اتصال انتهای´3 پرایمر
اهمیت نوکلئوتید انتهایی در هنگام طویل سازی توسط پلی مراز دیده می شود. اگر انتهای´ 3 به جایگاه غیر اختصاصی متصل شود، باعث جایگزینی باز غیر اختصاصی در الگو می شود. میزان پایداری اتصال پرایمر از روی تغییرات انرژی آزاد گیبس (∆G) قابل مقایسه است. انرژی آزاد گیبس (∆G) کمیتی ترمودینامیکی است که میزان خود به خود انجام شدن یک واکنش را نشان می دهد. انجام یک فرآیند از لحاظ ترمودینامیکی هنگامی امکان پذیر است که تغییرات انرژی آزاد گیبس منفی باشد.
-
مناطق مکمل داخلی
در زمان طراحی پرایمر به تکرارهای گوانیزینی و سیتوزینی توجه داشته باشید، چون این مناطق تکراری باعث تشکیل ساختار سنجاق سری شده و مانع اتصال کامل پرایمر و الگو می شود. در نتیجه غلظت محصول کاهش پیدا می کند. ساختارهای ثانویه باعث کاهش دسترسی پرایمر به الگو می شود. در زمان طراحی پرایمر به انرژی تشکیل ساختار سنجاق سری توجه کنید که در سطح پایینی باشد. به طور بهینه Hairpain در انتهای´ 3 با ∆G کمتر ازkal/mol 2- و Hairpain داخلی با ∆G کمتر ازkal/mol 3- قابل تحمل است. البته پرایمرهای دارای ساختار سنجاق سری در روش های PCR کاربرد زیادی دارند.
مراقب باشید که نواحی مکملی بین دو تا پرایمر بین پرایمرهای بالا با پایین که باعث ایجاد دایمر پرایمر متقابل ( تعامل مولکولی بین دو پرایمر از یک سنس) یا خود پرایمرهای سنس با سنس یا پرایمر آنتی سنس با آنتی سنس که باعث ایجاد self dimer ( تعامل مولکولی بین دو پرایمر از یک سنس ) می شوند را باید در نظر گفت. این توالی مکمل در انتهای´3 به علت اهمیت این ناحیه در شروع سنتز از اهمیت بیشتری برخوردار است.
به طور بهینه وجود دایمرself dimer در انتهای ´3 با ∆G کمتر از kal/mol 5- و self dimer داخلی با ∆G کمتر از kal/mol 6- قابل تحمل است. در مورد Cross dimer primer نیز به طور بهینه وجود Cross dimer primer درانتهای´3 با ∆G کمتر ازkal/mol 5- و Cross dimer primer داخلی با ∆G کمتر از kal/mol 6- قابل تحمل است.
اتصال پرایمرها به صورت دایمر باعث ایجاد قطعاتی با طول بین 100-50 نوکلئوتید می شود، که مقدار زیادی از حجم پرایمر و dNTPs را مصرف می کنند، در این حالت بر روی ژل آگارز یا آنالیز ذوب شما دارای یک باند اضافی علاوه بر باند قطعه اصلی خود می باشید. زمانی هم که تنها این باند 100-50 نوکلئوتیدی را مشاهده می کنید، نشان دهنده ی مشکلات بیشتر از جمله میزان حجم اولیه بالای پرایمر، کم بودن الگوی مورد نظر، اختصاصی نبودن پرایمر، میزان زیاد آنزیم پلی مراز، تعداد سیکل زیاد واکنش و … است.
در پروتکل های Multiplex PCR ( که از چندین جفت پرایمر برای شناسایی چند نوع ژن در یک واکنش استفاده می شود) تشکیل دایمر بیشتر اتفاق می افتد زمانی که مجبور به این کار هستید، می توانید از نوکلئوتیدهای آنالوگ 7- دآزا-2´- داکسی گوانوزین به جای نوکلئوتید گوانوزین در مخلوط واکنش استفاده کنید. این آنالوگ گوانوزین به علت انرژی هیبریداسیون پایین در اتصال با سیتوزین، احتمال جفت شدگی را کاهش می دهد، پس به همین نسبت امکان اتصال به الگوهای ناخواسته کاهش می یابد.
-
انتخاب جایگاه پرایمر مناسب
نواحی ژنی را که برای طراحی پرایمر انتخاب می کنید، بهتر است نواحی حفاظت شده باشند. این نواحی مناطقی هستند که در آن جهش رخ نمی دهد یا کمتر رخ می دهد و به نواحی Conserved sequence معروف هستند. به خصوص در زمان طراحی پرایمر برای توالی ویروس ها و باکتری ها، با مطالعه ساختار ژنومی میکروارگانیسم مورد نظر نواحی حفاظت شده را می توانید پیدا کنید و بهتر است پس از آن با همردیف (Align) کردن توالی مورد نظرتان، توالی مشترک بین همه ی توالی های انتخاب شده را پیدا کنید و برای آن ناحیه به طراحی پرایمر بپردازید.
در مورد ژنوم انسانی یا سایر حیوانات به علت ثبات ژنی نیاز کمتری به این کار می باشد، مگر اینکه ژن مورد نظر دارای چند رونوشت باشد. در مواردی که میخواهید پرایمر بین گونه ای را برای یک ژن مشترک طراحی کنید، نیاز به انجام مرحله همردیف کردن توالی ها بیشتر احساس می شود. زمانی که نواحی مشترک بین توالی کم بود و در موقعیت های خاصی نوکلئوتیدهای متفاوتی وجود داشت، می توانید با طراحی پرایمر دژنره مشکل را برطرف کنید.
پرایمرهای دژنره، پرایمرهایی هستند که در یک یاچند نوکلئوتید باهم تفاوت دارند که به صورت مشترک در مخلوط واکنش وارد می شوند. در واقع شما دارای چند جفت پرایمر بسیار شبیه به هم می باشید که احتمال اتصال به ژنوم هایی که تفاوت های مختصریبا هم دارند را بیشتر می کند. برای طراحی و سفارش این مدل پرایمر شما می توانید از کدهای حروفی استاندارد استفاده کنید. به عنوان مثال وقتی نیاز دارید که در توالی پرایمر طراحی شده بعضی در یک نقطه ی خاص حاوی باز G و بعضی حاوی باز A باشند، از کد Rبرای سفارش این نوع پرایمر استفاده می کنید.
بهینه سازی غلظت پرایمر
یکی از حساس ترین نکات موجود در واکنش PCR غلظت پرایمر برای انجام هر چه بهتر و حساس تر واکنش می باشد، که نیاز به بهینه سازی غلظت پرایمر به منظور پیدا کردن نسبت مناسب بین پرایمر، الگو و میزان MgCL2 دارد.
می توان برای بهینه سازی غلظت پرایمر مراحل زیر را انجام داد:
1.برای این کار 10 میکرولیتر از پرایمر بالا و پایین در دو تیوپ جداگانه آماده کنید.
- از چاهک 2 تا 5، به هر کدام 5 میکرولیتر آب اضافه کنید.
- از چاهک شماره 1 که حاوی 10 میکرولیتر پرایمر بالا می باشد، 5 میکرولیتر پرایمر به چاهک شماره 2 اضافه کنید و خوب مخلوط کنید( حداقل 5 باز پیپت کنید).
- در این مرحله 5 میکرولیتر از مخلوط چاهک شماره 2 به 3،3 به 4 و 4 به 5 اضافه و خوب مخلوط کنید.
- برای پرایمر پایین نیز همین سریال رقت را درست کنید. غلظت نهایی هر کدام از پرایمرهای بالا و پایین به صورت جداگانه 10 پیکومول، 5 پیکومول، 2.5پیکومول،1.25 پیکومول و 0/625 پیکومول خواهد بود.
- حالا با استفاده از یک پلیت 96 خانه ای PCR یا 5 عدد استریپ 8 تایی، رقت های آماده را به چاهک های مورد نظر اضافه کنید.
0/5 میکرولیتر از هر کدام از رقت های آماده پرایمر بالا را در 5خانه ی اول از ستون 1 تا 5 و 5/0 میکرولیتر از رقت های آماده پرایمر پایین را در 5 خانه ی اول ردیف A تا E اضافه کنید.
- حالا مخلوط واکنش و الگو را به میزان مساوی برای همه چاهک ها طبق پروتکل اضافه می کنیم (حجم نهایی 20 میکرولیتر است).
- بعد از انجام PCR ارزیابی میزان فلورسنت واکنش (Rn∆) برای تمام چاهک های مخلوط واکنش را انجام داده و کمترین Ct و بالاترین فلورسنس را به عنوان حساس ترین و تکرار پذیرترین غلظت پرایمر محاسبه می کنیم.
(¹long and accurode PCR)
1-در این پروتکل برای طراحی پرایمر، پرایمرهای طراحی شده بین 21 تا 30 جفت باز طول دارند، با میزان 50 GCدرصد دمای اتصال بین 60تا 72 درجه، نمونه الگو DNA تازه و با کیفیت ( برای دپورینه شدنف الگو را در بافر با PH:9 و در دمای 25 درجه قرار دهید) و دمای بهینه طویل سازی 68 درجه.
شرایط طراحی پروب
پروب ها پرایمرهای نشان داری هستند که حاوی یک گروه اتصالی اضافی برای ردیابی بهتر پرایمر می باشند. این گروه اضافی می تواند خاصیت فلورسنس داشته باشد شما می توانید از پروب های با یک خاموش کننده یا پروب های با دو خاموش کننده استفاده کنید. پیشنهاد می شود که از پروب های با دو خاموش کننده استفاده کنید، زیرا فلورسانس پس زمینه پایین تری را نشان می دهند و در نتیجه در مقایسه با پروب های تک خاموش کننده داراری سیگنال قوی تری هستند.
پروب هایی با دوخاموش کننده دارای یک خاموش کننده داخلی ZEN یا TAO هستند. خاموش کننده داخلی در پروب های با طول بلندتر باعث ایجاد خاصیت خاموش کنندگی قوی تر و در نتیجه افزایش سیگنال بالاتری می شوند.
اگر از پروب های با یک خاموش کننده استفاده می کنید، سعی کنید طول آن 20 تا 30 باز باشد؛ این باعث می شود که خاموش کننده به طور بهینه فلورسانس رنگ را جذب کند ( پروب با طول بیش از 30 باز، کارایی کمتر در خاموش کنندگی گزارشگر دارد).
نکات مهم طراحی پروب
1- در حالت ایده آل بهتر است پروب در مجاورت پرایمر سنس یا پرایمر آنتی سنس باشد، اما نباید با سایت اتصال پرایمر بر روی همان رشته هم پوشانی داشته باشد، در این صورت پروب را می توان بر روی رشته ی دیگری از الگوی هدف قرار داد.
2- دمای Tm پروب باید 6 تا 8 درجه بالاتر باشد، اگر Tm پایین باشد، درصد احتمال اتصال پروب به هدف کاهش می یابد. در این مورد پرایمر ها، تکثیر را پیش از اتصال پروب شروع کرده، اما چون سایت های هدف با اتصال پروب اشباع نشده اند، حساسیت کاهش پیدا می کند و سیگنال فلورسانس کم شده که نشان دهنده ی مقدار واقعی از حضور هدف در نمونه نمی باشد.
3- دمای Ta نباید 5 درجه کمتر از دمای Tm پرایمر باشد.
4- درصد GC پروب همانند توالی پرایمر، بهتر است که بین 35 تا 65 درصد باشد و از قرار دادن G در انتهای´5 پروب به دلیل اثر منفی بر روی خاموش کننده اجتناب کنید.
راهنمای کلی برای طراحی پرایمر و پروب
پرایمر و پروب باید از نظر وجود self-dimer، Crosse-dimer، Hairpain و ∆G هر کدام از پرایمرها چک شود. اعداد مثبت G∆ نشان دهنده ی این است که ساختار دوم واقعی در این حالت دیده نمی شود.
بطور معمول برای امپلیکون هایی با اندازه ی bp 70-150 به راحتی می توان پرایمر و پروب با Tm مناسب طراحی نمود. این طول قظعه مناسب ترین شکل ممکن با استفاده از شرایط استاندارد معمول می باشد. طول های بلندتر 500 باز نیز می تواند تولید شود، اما شرایط واکنش نیاز به تغییر برای افزایش زمان Extension دارد.
در زمان آنالیز بیان ژن با استفاده ازm RNA ، نمونه RNA از نظر RNase Free بودن و استفاده از DNase I پیش از انجام واکنش بررسی کنید. در مواردی ممکن است نیاز باشد پرایمر را طوری طراحی کنید که تنها به RNA یا همان Cdna ساخته شده متصل شود. از نواحی اتصالات اگزون-اگزون برای طراحی استفاده کنید که احتمال تشخیص DNA ژنومی و تکثیر اشتباه کم شود.
برای دریافت خدمات مربوط به دوره طراحی پرایمر و سفارش طراحی پرایمر
از طریق لینک خدمات آزمایشگاهی می توانید اقدام نمایید