توالی یابی به روش نیمه رسانا یا توالی یابی Ion torrent یکی از روش های توالی یابی نسل دوم (NGS)
تکنیک تعیین توالی نیمه رسانا Ion torrent یکی از روش های توالی یابی نسل دوم (NGS) بر اساس سنتز می باشد که آسانتر، سریع تر و مقرون به صرفه تر از روش های پیشین است.
شرکت Life Technologies در سال 2010 فرم رومیزی(Benchtop) دستگاه تعیین توالی نیمه رسانا Ion Torrent را با نام(PGM) Personal Genome Machine به صورت تجاری به بازار عرضه کرد. دومین دستگاه تعیین توالی Ion Torrent در سال 2012 تحت عنوان Ion Proton به بازار عرضه گردید که میزان خروجی آن که 10Gb در مدت زمان 2 الی 8 ساعت است، در مقایسه با PGM که خروجی 1Gb در مدت زمان 2 الی 3 ساعت دارد، افزایش به سزایی داشت.
هر کدام از این دستگاه ها بر حسب میزان خروجی خود جهت اهداف تحقیقاتی متفاوتی به کار گرفته می شوند به گونه ای که جهت تعیین توالی بخش های خاص از ژنوم PGM و برای تعیین توالی کل ژنوم Ion Proton کاربرد دارد.
در این روش نیز مراحل آماده سازی نمونه و تعیین توالی هم چون روش Pyrosequencing می باشد یعنی جهت تکثیر قطعات به طول 200 جفت باز حاوی سازگار دهنده متصل به مهره ها از روش امولسیون PCR (emPCR/Emulsion PCR) در قطرات آب داخل محلول روغنی استفاده می شود و سپس مهره ها در ریز چاهک ها توزیع می گردند و تعیین توالی توسط سنتز در هر یک از ریز چاهک ها به وقوع می پیوندد.
بر خلاف روش Pyrosequencing که از واکنش های نوری جهت تعیین توالی استفاده می شود، در این روش تغییرات PH در اثر آزاد شدن یون های هیدروژن در هنگام پلیمریزه شدن DNA مورد بررسی قرار می گیرد.
روش کار به این صورت است که یک چاهک ریز(Microwell) حاوی یک رشته DNA الگو که باید توالی یابی شود با یک گونه منفرد از تری فسفات دئوکسی ریبونوکلئوتید(dNTP) پر شده است. اگر dNTP معرفی شده مکمل نوکلئوتید الگوی اصلی باشد، در رشته مکمل در حال رشد گنجانده می شود. این موضوع باعث آزاد شدن یک یون هیدروژن می شود که حسگر یون ISFET را تحریک می کند، که نشان می دهد واکنشی رخ داده است. اگر تکرارهای هموپلیمر در توالی الگو وجود داشته باشد، چندین مولکول dNTP در یک چرخه واحد گنجانده می شودکه منجر به تعداد متناظر هیدروژن های آزاد شده و سیگنال الکترونیکی نسبتاً بالاتری می شود.
صفحات حسگر فوق حساس یونی که در پایین ریز چاهک ها تعبیه شده اند، تغییرات PH را شناسایی می کنند و این تغییرات به صورت تغییر ولتاژ ثبت می شوند و به صورت یک پیک در نمایشگر ظاهر می شوند. در این روش هم انواع نوکلئوتیدهای T,A,G,C به طور پی در پی به واکنش اضافه می گردند و این صورت شناسایی نوع نوکلئوتید افزوده شده با علائم ولتاژی امکان پذیر می گردد.
روش توالی یابی Ion Torrent به مواد فلورسنت و دوربین نیازی ندارد از این رو سریع تر و کم هزینه تر است و ابعاد دستگاه نیز کوچک تر می باشد. در ارتباط با همو پلیمرها به نسبت تعداد نوکلئوتیدهای رشته الگو ، شدت سیگنال افزایش پیدا می کند؛ اما این ارتباط خطی نمی باشد و امکان تشخیص صحیح در مورد توالی های بلند تر از 6 بازی کاهش می یابد.
اگر تکرارهای هموپلیمری از همان نوکلئوتید(به عنوان مثال TTTTT) روی رشته الگو (رشته ای که باید توالی یابی شود) وجود داشته باشد، چندین نوکلئوتید معرفی شده ترکیب می شوند و یون های هیدروژن بیشتری در یک چرخه آزاد می شوند. این منجر به تغییر pH بیشتر و سیگنال الکترونیکی به نسبت بیشتری می شود. این یکی از محدودیتهای سیستم است، زیرا شمارش تکرارهای طولانی دشوار است.
این محدودیت با تکنیکهای دیگری که افزودنهای تک نوکلئوتیدی را شناسایی میکنند، مانند پیروسکانس مشترک است. تشخیص سیگنال های تولید شده از یک عدد تکرار بالا از تکرارهای یک عدد مشابه اما متفاوت دشوار است. به عنوان مثال، همو تکرارهای طول 7 به سختی از تکرارهای طول 8 متمایز می شوند.
یکی دیگر از محدودیت های این سیستم کوتاه بودن طول خواندن در مقایسه با سایر روش های توالی یابی مانند توالی سنجی سنگر یا پیروسکانس است. طول خواندن طولانی تر برای اسمبلی ژنوم de novo مفید است. توالی یابی Ion torrent، میانگین طول خواندن تقریباً 400 نوکلئوتید در هر خوانش تولید میکنند. توان عملیاتی این روش در حال حاضر کمتر از سایر فناوریهای توالییابی با توان بالا است، اگرچه توسعهدهندگان امیدوارند با افزایش چگالی تراشه، آن را تغییر دهند.
