استخراج DNA به روش فنل کلروفرم
استخراج DNA به روش فنل کلروفرم یکی از روش های شیمیایی استخراج DNA است که در سال 1998 به وجود آمد. انواع روشهای استخراج DNA شامل روش های فیزیکی و شیمیایی است. که استخراج DNA به روش فنل کلروفرم جز روش های شیمیایی محسوب می شود.
مطالعات در رابطه با بهداشت و سلامت انسان در زمینه زیست شناسی مولکولی نیاز به استفاده از دی اکسی ریبونوکلئیک اسید (DNA)، اسید ریبونوکلئیک (RNA) و نمونه های پروتئینی دارد. استفاده موفق از برنامه های کاربردی پایین دست در دسترس از استفاده از مقدار زیاد و DNA با کیفیت بالا بهره مند خواهد شد.
استخراج DNA یک گام کلیدی در روش های آزمایشگاهی مورد نیاز برای انجام برنامه های تحقیقاتی مولکولی است. تکنیک هایی که جهت استخراج DNA استفاده می شوند، بسته به منبع نمونه، اندازه و قدمت آن، الزامات فنی، بازده زمانی، مقرون به صرفه بودن، و همچنین نمونه های بیولوژیکی مورد استفاده و جمع آوری و ذخیره سازی آن ها متفاوتند باشد.
خون کامل یکی از بیشترین منابع موجود برای به دست آوردن DNA ژنومی (gDNA) است و به طور گسترده در تأسیسات سراسر جهان استفاده می شود. استخراج DNA از نمونه های مختلف مایعات بدن (خون، بزاق و …)، بافت های زنده و فیکس شده، سلول ها، باکتری ها و …امکان پذیر می باشد که با وجود پروتکل های متنوعی که برای هر کدام وجود دارد، وجه اشتراک همه ی آن ها جدا کردن DNA از سایر اجزای سلولی است.
اولین جداسازی اسید دئوکسی ریبونوکلئیک (DNA) در سال 1869 توسط فردریش میشر انجام شد. در حال حاضر این یک روش معمول در بیولوژی مولکولی یا آنالیزهای پزشکی قانونی در نظرگرفته می شود. در روش شیمیایی، کیت های مختلفی برای استخراج استفاده می شود.
در روشهای مختلف استخراج DNA از شیوه های رایجی استفاده می شود که هدف همه آنها از هم گسیختگی مؤثر سلول‌ها، دناتوره کردن کمپلکس های نوکلئوپروتئین، غیرفعال‌سازی نوکلئازها و سایر آنزیم‌ها، حذف آلاینده های بیولوژیکی و شیمیایی و در نهایت رسوب DNA است. استفاده از معرف های آلی و غیر آلی و روش های سانتریفیوژ. که در نهایت، آنها به انواع روند خودکار و کیت‌های تجاری موجود تبدیل شده‌اند.
انواع روش های استخراج DNA به حجم کل نمونه های بالینی بدست آمده بستگی دارد. با این حال، پروتئیناز K و RNase به ترتیب گروه های پروتئینی مانند لیپیدها را حذف کرده و RNA را تجزیه می کنند.
لیز سلولی یک مرحله رایج در اکثر پروتکل های استخراج DNA است و معمولاً از طریق استفاده از مواد شوینده و آنزیم ها به دست می آید. سدیم دودسیل سولفات (SDS) و Triton™ X-100 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) نمونه‌هایی از شوینده‌هایی هستند که برای حل کردن غشای سلولی استفاده می‌شوند.
آنزیم ها همچنین با مواد شوینده ترکیب می شوند تا سطح سلول یا اجزای سیتوزولی را هدف قرار دهند. پروتئیناز K یک آنزیم رایج مورد استفاده در پروتکل های مختلف برای جدا کردن گلیکوپروتئین ها و غیر فعال کردن RNase ها و DNase ها است. سایر مواد دناتوره‌کننده مانند اوره، نمک‌های گوانیدینیم، و آشوب‌گردهای شیمیایی نیز برای مختل کردن سلول‌ها و غیرفعال کردن آنزیم‌های سلولی استفاده شده‌اند، اما این مواد می‌توانند بر کیفیت و عملکرد اسید نوکلئیک تأثیر بگذارند.
استخراج DNA به روش فنل کلروفرم
یکی از بهترین و رایجترین روش های استخراج DNA به روش دستی، استخراج DNA به روش فنل کلروفرم است که توسط بارکر در سال 1998 بوجود آمد. در تکنیک استخراج DNA به روش فنل کلروفرم ابتدا بافت مورد نظر با محلول خاصی به نام بافر لیز مانند (سدیم دودسیل سولفات) SDS لیز و پروتئیناز K برای هضم آنزیمی پروتئین ها و اجزای سلولی اسید غیرنوکلئیک استفاده می شود.
بافر لیز حاوی Tris ،EDTA ،MgCl2 ،NaCl ،SDS و سایر نمک ها است. اجزای بافر لیز نقش کمک کننده ای در تخریب غشای سلول و همچنین تخریب غشای هسته ایفا می کنند. بخش پروتئینی سلول با کمک کلروفرم و فنل که از دسته ترکیبات آلی هستند، دناتوره می شود. بافرها با EDTA مخلوط می شوند.
در مرحله بعد، با اصافه کردن ترکیبی از فنل و کلروفرم/ایزوآمیل الکل، پروتئین ها دناتوره می شوند این روش همچنین به حذف پروتئین ها کمک می کند. پس از سانتریفیوژ، فنل در پایین لوله جمع می شود و DNA در فاز آبی قرار می گیرد در حالی که پروتئین دناتوره به صورت یک لایه نازک سفید رنگ بین هر دو لایه باقی می ماند برای حذف پروتئین های رسوب داده شده، استخراج ادامه می یابد.
در این مرحله برای این منظور غلظت بالایی از نمک استفاده می شود. سپس دو بار شستشو با اتانول 70% DNA را رسوب می دهد، با اینکار درصد بالایی از DNA استخراج می شود. پس از جداسازی، DNA در یک بافر کمی قلیایی، معمولا در یک بافر TE یا در آب فوق خالص حل می شود.
فنل و کلروفرم ، DNA دو رشته ای را بازیابی می کند که برای روش های اولیه RFLP مورد نیاز است. در حالی که این روش یکی از قابل اعتمادترین و کارآمدترین روش ها است، ولی بسیار وقت گیر و زمانبر است. به استفاده از مواد شیمیایی خطرناک به همین دلیل روش خطرناکی برای استخراج DNA محسوب می شود.
استخراج DNA به روش فنل کلروفرم جز روشهای کم هزینه استخراج DNA است و مقادیر زیادی DNA خالص نیز در این روش تولید می شود. چندین پروتکل مبتنی بر استخراج آلی DNA به طور موثر دهه‌ها پیش توسعه یافتند، اگرچه نسخه‌های بهبودیافته و کاربردی‌تری از این پروتکل‌ها نیز در سال‌های گذشته توسعه و منتشر شده‌اند.
رسوب DNA با افزودن غلظت های بالایی از نمک به محلول های حاوی DNA به دست می‌آید، زیرا کاتیون های نمک هایی مانند استات آمونیوم با دافعه ناشی از بار منفی ستون فقرات فسفات مقابله می‌کنند. مخلوطی از DNA و نمک ها در حضور حلال هایی مانند اتانول (غلظت نهایی 70٪ – 80٪) یا ایزوپروپانول (غلظت نهایی 40٪ – 50٪) باعث رسوب اسیدهای نوکلئیک می شود.
برخی از پروتکل ها شامل مراحل شستشو با اتانول 70 درصد برای حذف نمک اضافی از DNA هستند. در نهایت، اسیدهای نوکلئیک مجدداً در آب یا بافر TE معلق می‌شوند (10 میلی‌مولار تریس، 1 میلی‌مولار اتیلن دی‌آمین تترا استیک اسید [EDTA]).
بافر 7-9 TE معمولاً برای ذخیره‌سازی طولانی‌مدت DNA استفاده می‌شود، زیرا از آسیب دیدن آن توسط نوکلئازها، جلوگیری می‌کند. pH، فلزات سنگین و اکسیداسیون توسط رادیکال های آزاد. تریس PH ایمن 7-8 را فراهم می کند و EDTA یون های دو ظرفیتی مورد استفاده در فعالیت نوکلئاز را کلات می کند و با آسیب اکسیداتیو ناشی از فلزات سنگین مقابله می کند.
برای دریافت خدمات مربوط به استخراج DNA از انواع نمونه ها
از طریق لینک خدمات آزمایشگاهی می توانید اقدام نمایید
