استخراج DNA به روش Salting Out

یکی از روش های متداول برای استخراج DNA استفاده از نمک های اشباع می باشد،که موسوم به استخراج DNA به روش Salting Out (استخراج DNA به روش سالتینگ اوت) یا استخراج DNA به روش رسوب دهی نمک می باشد. همچنین استخراج DNA بهروش رسوب دهی نمک ایمن تر و با کیفیت تر از روش فنل-کلروفرم است.

مولکول دئوکسی ریبونوکلئیک اسید (DNA) یکی از مهمترین مولکول‌های زیستی است که حاوی تمام اطلاعات ژنتیکی و وراثتی موجودات زنده  را حمل می‌کند. این دستورالعمل های ژنتیکی برای کارکرد و توسعهٔ زیستی جانداران و ویروس‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. DNA، همراه با دستورالعمل های موجود در آن، در طول تولید مثل از والدین به فرزندان آنها به ارث می رسد.

هر توالی DNA که حاوی دستورالعمل هایی برای ساخت یک پروتئین است به عنوان ژن شناخته می شود. اندازه یک ژن ممکن است بسیار متفاوت باشد، از حدود 1000 باز تا 1 میلیون باز در انسان. ژن ها تنها حدود 1 درصد از توالی DNA را تشکیل می دهند. توالی‌های DNA خارج از این 1 درصد در تنظیم زمان، چگونگی و میزان تولید پروتئین نقش دارند.

در یوکاریوت ها، DNA در ناحیه خاصی از سلول به نام هسته یافت می شود. از آنجایی که سلول بسیار کوچک است و از آنجا که موجودات مولکول های DNA زیادی در هر سلول دارند، هر مولکول DNA باید بسته بندی محکمی داشته باشد. این شکل بسته بندی شده از DNA کروموزوم نامیده می شود. محققان از DNA یافت شده در هسته سلول به عنوان DNA هسته ای یاد می کنند. به مجموعه کامل DNA هسته ای یک موجود، ژنوم آن می گویند.

علاوه بر DNA واقع در هسته، انسان و سایر موجودات پیچیده نیز دارای مقدار کمی DNA در ساختارهای سلولی به نام میتوکندری هستند. میتوکندری انرژی مورد نیاز سلول برای عملکرد صحیح را تولید می کند.

در تولید مثل جنسی، موجودات زنده نیمی از DNA هسته خود را از والد مذکر و نیمی از والدین ماده را به ارث می برند. با این حال، موجودات زنده تمام DNA میتوکندری خود را از والدین ماده به ارث می برند. این به این دلیل است که فقط سلول های تخمک و نه سلول های اسپرم، میتوکندری خود را در طول لقاح حفظ می کنند.

DNA از بلوک های ساختمانی شیمیایی به نام نوکلئوتید ساخته شده است. این بلوک های ساختمانی از سه قسمت تشکیل شده اند: یک گروه فسفات، یک گروه قند و یکی از چهار نوع پایه نیتروژن. برای تشکیل رشته‌ای از DNA، نوکلئوتیدها به زنجیره‌هایی متصل می‌شوند که گروه‌های فسفات و قند متناوب هستند.

چگونه از توالی DNA برای ساخت پروتئین استفاده می شود؟

دستورالعمل های DNA برای ساخت پروتئین ها در یک فرآیند دو مرحله ای استفاده می شود. ابتدا آنزیم ها اطلاعات موجود در یک مولکول DNA را می خوانند و آن را به یک مولکول واسطه ای به نام اسید ریبونوکلئیک پیام رسان یا mRNA رونویسی می کنند.

سپس، اطلاعات موجود در مولکول mRNA به “زبان” آمینو اسیدها که بلوک های سازنده پروتئین ها هستند، ترجمه می شود. این زبان به ماشین‌ های پروتئین‌ ساز سلول پیام می دهد، که ترتیب دقیق در آن آمینو اسیدها را برای تولید یک پروتئین خاص پیوند دهند. این یک کار مهم است زیرا 20 نوع اسید آمینه وجود دارد که می توانند به ترتیب های مختلف قرار بگیرند تا طیف گسترده ای از پروتئین ها را تشکیل دهند.

برای سال‌های متمادی، دانشمندان بحث می‌کردند که کدام مولکول دستورالعمل‌های بیولوژیکی حیات را حمل می‌کند. بیشتر آنها فکر می کردند که DNA یک مولکول بسیار ساده است که نمی تواند چنین نقش حیاتی ایفا کند. در عوض، آن‌ها استدلال کردند که پروتئین‌ها به دلیل پیچیدگی بیشتر و شکل‌های متنوع‌تر، احتمال بیشتری برای انجام این عملکرد حیاتی دارند.

فردریش میشر (Friedrich Miescher ) پزشک سوئیسی، اولین بار DNA را در اواخر دهه 1800 مشاهده کرد. اما نزدیک به یک قرن از آن کشف گذشت تا اینکه محققان ساختار مولکول DNA را کشف کردند و به اهمیت اصلی آن در زیست شناسی پی بردند. در سال 1869، او از لکوسیت‌هایی که از نمونه‌ها روی باندهای جراحی تازه جمع‌آوری کرده بود استفاده کرد و آزمایش‌ هایی را برای خالص‌ سازی و طبقه‌ بندی پروتئین‌ های موجود در این سلول‌ ها انجام داد.

درک ما از ماده ژنتیکی از زمانی که فریدریش میشر اولین استخراج DNA را انجام داد، به طور قابل توجهی افزایش یافته است. اولین استخراج، کشف ساده ای بود که نشان داد ماده ای در سلول ها وجود دارد که از محلول خارج می شود و به محلول قلیایی می رسد. سال 1953 ساختار DNA مشخص شد. اندکی پس از آن، روش های آزمایشگاهی استاندارد برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک پدیدار شد.

تکنیکی که برای جداسازی DNA کامل خون انتخاب می‌کنید نه تنها بر نتایج شما تأثیر می‌گذارد، بلکه بر سهولت گردش کار زیست‌ شناسی مولکولی شما نیز تأثیر می‌گذارد. مانند بسیاری از تکنیک های علمی دیگر، انتخاب روش استخراج می تواند به خودی خود یک چالش باشد! آزمایشگاه ها معمولاً پروتکل آزمایش شده و آزمایش شده ترجیحی خود را دارند.

پروتکل ها می توانند در مورد تنظیم و مواد شیمیایی دقیق مورد استفاده برای لیز سلول ها و جداسازی انتخابی DNA متفاوت باشند. با این حال، تقریباً تمام پروتکل‌های موجود برای جداسازی DNA کامل خون شامل این مراحل رایج است: لیز سلولی، حذف پروتئین، سایر آلاینده‌ها و RNA، و (در نهایت) بازیابی DNA.

روش های مختلفی برای استخراج DNA از خون کامل استفاده شده است. در اکثر این روش ها از آنزیم ها (مانند پروتئیناز K و RNAse A) یا حلال های آلی سمی (مانند فنل یا گوانیدین ایزوتیوسیانات) استفاده می شود. از آنجایی که این آنزیم ها گران هستند و بیشتر موادی که به طور معمول استفاده می شوند سمی اند، استفاده از روش استخراج DNA کارآمد که نیازی به استفاده از چنین موادی ندارد، مطلوب است که یکی از این روش ها DNA،روش رسوب دهی نمک (Salting out) می باشد.

استخراج DNA به روش رسوب دهی نمک (استخراج DNA به روش سالتینگ اوت)

استخراج DNA به روش رسوب دهی نمک یک روش غیر سمی است که توسط میلر، دایکز و پولسکی در سال 1988 مطرح شد.  گزارش شده است.  استخراج DNA به روش سالتینگ اوت در مقایسه با روش فنل-کلروفرم  از این جهت برتری دارد که کارآمدتر و مقرون به صرفه‌ تر و  همچن با کیفیت بالاتر انجام می شود و مهم‌تر از همه، معرف‌ های مورد استفاده غیرسمی هستند. همچنین برای استخراج DNA از خون، کشت سوسپانسیون یا هموژن بافت استفاده می شود.

پروتکل استخراج DNA از خون به روش رسوب دهی نمک

1. همه سلول های هسته دار DNAدارند. بنابراين، در بافت هایی مثل خون فقط گلبول های سفيد DNA دارند و گلبول های قرمز DNA ندارند، پس در ابتدا باید از شر گلبول های قرمز خلاص شوید به این منظور، مقداری خون را در تیوب ریخته و  تقریبا دو برابر حجم خون آب مقطر سرد به آن اضافه نمائید پدیده اسمز در گلبول‌های قرمز  باعث می شود مولکول‌های آب از جدارهی نیمه تراوای گلبول قرمز عبور کرده و به درون گلبول قرمز راه ‌یابند، در نتیجه مقدار آب درون گلبول رفته رفته افزایش یافته تورژسانس رخ می دهد و منجر به پاره شدن جدارهی سلول خونی و لیز آن می شود.

در این مرحله می توان به جای آب مقطر سرد از بافر لیز کننده گلبول قرمز شامل NH₄Cl، KHCO₃ و   EDTAهمراه با Triton X100 نیز استفاده کرد تا نتیجه بهتری گرفت.

بعد از 10 الی 15 دقیقه شوک حرارتی و هم چنان تکان دادن پیاپی میکروتیوب، آن را سانتریفوژ نمایید.

این مرحله را تا زمان بی رنگ شدن رسوب و عدم مشاهده رنگ قرمز تکرار نمائید (حداقل دو تا سه مرتبه).

2. محلول رویی را دور ریخته و بر روی رسوب بافر لیز کننده هسته بریزید و با پیپتاژ رسوب را حل کنید.

این بافر عمدتا حاوی Tris-HCl،   EDTA ، NaCl،  sucrose می باشد.

3. در ادامه SDS 10%به محلول فوق اضافه کرده و می توانید به اختیار پروتئیناز K به محلول فوق اضافه نمایید که در حضور SDS در دمای 56 الی 65 به مدت 3 الی 16 ساعت به صورت بهینه موجب تخریب پروتئین­ها و همچنین unfold شدن آن­ها می­ شود.
4. NaCl اشباع به میکروتیوب واقع بر یخ اضافه کنید و 5 دقیقه بر روی یخ انکوبه نمائید، چندین مرتبه shake کرده و سپس  سانتریفوژ نمائید تا پروتئین ها رسوب کند.
5. سوپرناتانت را به میکروتیوب جدیدی منتقل نموده و بر روی آن هم حجم سوپرناتانت ایزوپروپانل ( و یا دو برابر حجم اتانول مطلق) سرد بریزید. ابتدا آهسته و سپس سریع تکان دهید تا کلاف DNA ظاهر شود و چند دقیقه در دمای  -20 درجه انکوبه نمایید، سپس سانتریفوژ کنید تا کلاف DNA رسوب نماید.
6. محلول رویی را تخلیه کرده و رسوب را در اتانول 75% حل نمائید. چندین مرتبه میکروتیوب را invert کرده و سپس سانتریفوژ نمائید، محلول رویی را خارج کرده و تیوب را در محیط آزمایشگاه و یا برای سرعت عمل بیشتر در دمای 56 درجه سانتیگراد قرار دهید تا خشک شود (برای حذف بقایای اتانول لازم است تمام جداره میکروتیوب و DNA خشک شود، اتانول در انجام PCR تداخل ایجاد می ­نماید. بدین دلیل لازم است تا آنجا که مقدور است در این مرحله حذف گردد) این مرحله حداقل 2 بار تکرار شود.
7. با توجه به اندازه کلاف تشکیل شده مقداری TE یا ddH₂O به آن اضافه کنید و در ادامه تیوب را به مدت 15-20 دقیقه در محیط آزمایشگاه قرار دهید تا رسوب حل شود و در نهایت به فریزر منتقل نمائید.
   

   

برای دریافت خدمات مربوط به استخراج DNA از انواع نمونه ها

از طریق لینک خدمات آزمایشگاهی می توانید اقدام نمایید

بیشتربخوانید

• مروری بر انواع روشهای استخراج DNA