✍ کاربرد MLPA در تشخیص بیماری ها

تکنیک MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) ، یک تکنیک مولکولی ساده، قدرتمند و پرکاربرد در زمینه بررسی بیماری‌های ژنتیکی است که نوعی multiplex PCR می باشد . این تکنیک امکان سنجش کمی توالی‌های نوکلئیک‌اسیدی را بسیار سریع و با کارایی بالا فراهم می‌کند که در سال ۲۰۰۲ توسط MRC-Holland معرفی و ارائه گردید.

تکنیک MLPA  توانایی افتراق بین توالی‌هایی  که تنها در یک نوکلئوتید با یکدیگر متفاوت اند را دارد. MLPA جهت تشخیص تعداد کپی‌های غیرعادی ژن‌ها (copy number) هم چون جهش‌های حذف و مضاعف‌شدن، تعیین وضعیت متیلاسیون DNA ،تعیین SNPها و جهش‌های نقطه‌ای و بررسی کمی mRNA به کار می‌رود؛ به گونه ای که قادر است بیش از ۵۰ نوع توالی DNA یا RNA ژنومی را به طور همزمان آنالیز و بررسی کند.

انتظار می رود که این تکنیک، در آینده‌ای نه چندان دور به تکنیکی مهم و پرکاربرد در آنالیز مولکولی اختلالات ژنتیکی و تایید و تشخیص آزمایشگاهی آن‌ها تبدیل شود.

برای رسیدن به آن چه گفته شد پنج مرحله زیر باید انجام گیرد:

۱)دناتوراسیون DNA و هیبریداسیون پروب‌های MLPA:

در این مرحله، DNA دناتوره شده  و به طور overnight با مخلوطی از پروب‌های MLPA  انکوبه می‌ گردد. هر پروب‌ MLPA شامل دو الیگونوکلئوتید مجزا از هم  می باشد که half-probe (۵′ and 3′ half-probes) گفته می شوند. هر یک از پروب‌ها،  دارای یکی از توالی‌های متصل‌شونده به پرایمر و توالی اختصاصی هدف هستند. توالی‌های هدف به طور معمول اگزونی خاص در ژن موردنظر می باشند. تمام پروب‌های مختلف مورداستفاده در یک واکنش MLPA،  توالی یکسانی جهت اتصال پرایمر دارند، که  مالتیپلکس کردن واکنش و تکثیر همزمان کل پروب‌ها را امکان پذیر می سازد.

در حین هیبریداسیون ،DNA الگو با این پروب‌ها هیبرید شده و دو الیگونوکلئوتید مربوط به پروب، دقیقا در کنار هم روی یک رشته، به توالی هدف متصل می‌ شوند. یکی از دو نیم‌ پروب‌ مورداستفاده و یا هر دوی آن‌ها، دارای توالی stuffer هستند که در نواحی هدف گوناگون، دارای طول متفاوتی است. همین موضوع باعث می شود که  multiplexing امکان پذیر شود و هم چنین محصولات تولیدشده هنگام الکتروفورز از یکدیگر متمایز شوند. از آن‌جایی که MLPA تکنیکی مالتیپلکس است، می‌توان آنالیز هر نمونه را به طور همزمان با بیش از ۶۰ پروب انجام داد و چندین ناحیه را مورد هدف قرار داد.

۲) واکنش ligation:

در مرحله (ligation) دو پرایمر به هم متصل می‌شوند. واکنش ligation فقط زمانی تحت تاثیر آنزیم DNA لیگاز می تواند انجام شود که هر دو پروب الیگونوکلئوتیدی به توالی‌هایی مجاور هم هیبرید شده باشند. لیگاز ligase-65 که آنزیمی وابسته به NAD می باشد برای این منظور استفاده می شود. سؤالی که در این جا پیش می آید این است که اگر هدف اتصال پروب‌ها به یکدیگر است، چرا از همان اول از دو پروب جداگانه استفاده می‌شود!؟ هر دو پروب جایگاه‌هایی برای متصل شدن به پرایمر دارند. پس اگر این پروب‌ها از اول مولکول‌هایی یکسان بودند، حتی در صورت نبود DNA هدف هم تکثیر می‌شدند و تکثیر غیراختصاصی انجام می‌ شد. آنزیم لیگاز به شدت اختصاصی عمل می‌کند. در صورت وجود کوچکترین mismatch میان پروب و توالی هدف، لیگاز توانایی اتصال پروب‌ها را ندارد و تکثیر انجام نخواهد شد. درنتیجه، MLPA قدرت تشخیص جهش‌های نقطه‌ای را داشته و حتی ژن‌های هدف واقعی و سودوژن‌ها را از هم جدا می کند.

۳) واکنش PCR:

دراین مرحله از آنزیم پلیمراز، dNTPها و پرایمرهای forward و reverse استفاده می شود. تکثیر نمایی تنها در مورد پروب‌هایی رخ می دهد که به وسیله ی پیوند کووالانسی به هم متصل شده باشند (واکنش ligation). از آن‌جایی که تمام پروب‌ها توالی مشترکی جهت اتصال به پرایمر دارند، بر خلاف multiplex PCR استاندارد، در MLPA تنها یک جفت پرایمر استفاده می شود. درنتیجه اضافه کردن فقط یک مجموعه پرایمری برای مطالعه تمامی توالی‌های هدف کافی است و تکنیک MLPA محدودیت‌های رایج ناشی از این موضوع که در multiplex PCR استاندرد وجود دارد، را ندارد. از آن جایی که مقدار محصول تولید شده با PCR، نسبت مستقیم با مقدار DNA هدف اولیه موجود در نمونه دارد، تعداد محصولاتی که از پروب‌های متصل‌شده ایجاد می‌شوند، معیاری برای سنجش تعداد توالی‌های هدف موجود در نمونه است. پرایمر forward با مواد فلورسنت لیبل می‌شود تا بررسی‌های کمی و مشاهده نتایج طی آنالیز امکان پذیر شود.

۴)تفکیک محصولات تکثیر از یکدیگر به کمک الکتروفورز مویرگی:

در این مرحله محصولات حاصل از تکثیر به وسیله ی الکتروفورز مویرگی در ژل دناتوره‌کننده بر اساس اندازه از هم تفکیک شده و تفاوت طول‌ها به صورت الگویی از پیک‌ها که الکتروفروگرام گفته می شود، نشان داده می‌شود. امپلیکون‌ها دارای طول‌هایی معین و متفاوت هستند که به خاطر توالی stuffer موجود در هر پروب خاص ایجاد می شود و آنالیز کمی را امکان پذیر می سازد.

۵) آنالیز داده‌ها:

پروب‌های الیگونوکلئوتیدی که به یکدیگر متصل نشده باشند، فقط یکی از پرایمرها را دارند. درنتیجه به جای تکثیر نمایی، این پروب‌ها به صورت خطی تکثیر شده و سیگنالی ایجاد نخواهند کرد. به همین دلیل، جداسازی و از بین بردن پروب‌های متصل نشده در MLPA لزومی ندارد و همین موضوع موجب می شود استفاده از آن آسان گردد. با نرمالیزاسیون مقایسه هر نمونه با مجموعه‌ای از نمونه‌های مرجع، می‌توان probe ratio را به دست آورد که مقدار DNA هدف موجود در نمونه را به طور نسبی مشخص می‌کند. این نسبت، تعداد کپی‌های موجود از هر ژن را مشخص می کند. کیفیت واکنش با تعیین پیک‌های کنترل ارزیابی می‌شود و اطلاعاتی را در مورد کارایی واکنش به ما می دهد.

از آن‌جایی که ژن‌های انسانی دیپلوئید هستند، در صورتیکه دو نسخه در نمونه موجود باشد، نسبت ۱ خواهد بود. معنی این نسبت آن است که پروب‌های موجود در نمونه باعث ایجاد تعداد ژن‌های یکسانی با نمونه مرجع شده‌اند. اگر نسبت، ۰/۵ باشد، فقط یک نسخه از ژن در فرد وجود دارد که احتمالا به معنی حذف هتروزیگوتی ژن هدف است. برعکس، اگر نسبت ۱/۵ باشد، ممکن است مضاعف‌شدگی هتروزیگوتی رخ داده باشد. حذف‌های هموزیگوتی به راحتی با تشخیص حضور یا عدم حضور پیک‌هایی خاص در ژن هدف، در صورت تکثیر نرمال پروب‌های کنترل مشخص می‌شوند. از طرف دیگر حذف‌های هتروزیگوتی و مضاعف‌شدگی‌ها پیک‌هایی با ارتفاع یا مکان قرارگیری متفاوت ایجاد می‌کنند.  واکنش‌های PCR با کارایی متفاوت در پروب‌ها و نمونه‌های مختلف، آنالیز نتایج را با چالش‌ هایی رو به رو خواهد کرد، از این رو نرم افزارهای مختلفی جهت آنالیز داده‌های MLPA توسعه پیدا کرده‌اند تا از داده‌های خام واکنش تفسیر درست‌تری برداشت شود. درنتیجه استراتژی‌های مختلفی به منظور آنالیز داده‌های MLPA توسعه پیدا کرده‌اند تا از داده‌های خام واکنش تفسیر درست‌تری برداشت شود. یکی از نرم‌افزارهای پر کاربرد، Coffalyser است که برنامه‌ای بر پایه excel بوده و تمام مراحل نرمالیزاسیون داده‌ها و اصلاح داده‌های sloping را انجام می‌دهد.

تکنیک MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

واریانت های تکنیک (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) MLPA