کاربرد مهم تست اکسیداز در آزمایشگاه تشخیصی
تست اکسیداز برای بررسی وجود آنزیم سیتوکروم اکسیداز(انتقال الکترون در تنفس هوازی) استفاده می شود و تست افتراقی برای تمایز گونه های سودوموناس، نایسریا، موراکسلا،ویبریو، کمپیلوباکتر، پاستورلا و بروسلا می باشد.
تست اکسیداز یکی از تست های بیوشیمیایی باکتری ها می باشد. از میان باکتری های بیماریزای گرم منفی نایسریا و پسودوموناس از نظر اکسیداز مثبت می باشند، در حالیکه خانواده انتروباکتریاسه اکسیداز منفی بوده و با انجام این تست ساده قابل افتراق هستند. آنزیم های اکسیداز نقش بسیار مهمی را در سیستم انتقال الکترون در تنفس هوازی ایفا می کنند. در این سیستم سیتوکروم اکسیداز اکسیژن با به عنوان گیرنده الکترون مورد استفاده قرار می دهد.
توانایی باکتری ها در تولید آنزیم سیتوکروم اکسیداز را می توان با انجام تست اکسیداز(Oxidase Test) مشخص نمود. آنزیم سیتوکروم اکسیداز قادر به اکسید کردن سوبسترای تترامتیل-پار-فنیلن دی آمین- دی هیدروکلراید و تشکیل محصول رنگی ایندوفنل (Indophenol) می باشد. اگر مقدار کمی از ارگانیسم تولید کننده این آنزیم را بر روی یک تکه کاغذ آغشته به سوبسترا بمالیم، رنگ ارغوانی تیره ای ایجاد می شود. این سوبسترا در حضور آنزیم اکسیداز و اکسیژن آزاد به عنوان دهنده الکترون عمل کرده و در اثر اکسید شدن به ترکیب سیاه رنگی تبدیل می شود.
باکتری هایی که اکسیداز منفی دارند ممکن است بی هوازی ، هوازی یا اختیاری باشند ؛ نتیجه منفی اکسیداز فقط به این معنی است که این موجودات سیتوکروم c اکسیداز ندارند که واکنش دهنده را اکسید می کند. آنها ممکن است با استفاده از دیگر اکسیدازها در انتقال الکترون تنفس کنند.)
پروتکل/روش انجام تست اکسیداز
در این تست محلول 1% تترامتیل پارافنیلن دی آمین دی هیدروکلراید مورد استفاده قرار می گیرد. معمولا می توان جهت مصرف روزانه 50 میلی گرم پودر را در ظروف درب دار کوچک پلاستیکی ریخته و 5 میلی لیتر آب مقطر به آن اضافه نموده و هر روز یک ویال را مورد استفاده قرار داد.
یک کاغذ صافی تمیز را در سطح یک پلیت استریل پلاستیکی قرار داده و آن را با چند قطره از معرف تازه مرطوب نمایید. مقدار کمی از کلنی جوان( کمتر از 24 ساعت) را با استفاده از یک اپلیکاتور چوبی تمیز برداشته و بر روی کاغذ صافی مرطوب شده قرار دهید.
از نظر تغییر رنگ کلونی ها به رنگ آبی و بنفش در مدت 10 تا 20 ثانیه بررسی کنید، دقت کنید که زمان بررسی رنگ اهمیت زیادی دارد. ارگانیسم هایی که دارای آنزیم اکسیداز هستند(گونه های جنس نایسریا) رنگ کلونی را در مدت 10 ثانیه به رنگ بنفش تغییر می دهند.
ارگانیسم هایی که فاقد این آنزیم هستند(مانند اشرشیا کولی) در مدت 10 ثانیه هیچ تغییر رنگی را ایجاد نمی نمایند. این واکنش در اثر اکسیداسیون در معرض هوا مثبت می شود، بنابراین اگر جواب آزمایش بعد از 20 تا 30 ثانیه خوانده شود نتیجه مثبت کاذب داده و ارزش تشخیصی ندارد.
نکات مهم در حین انجام آزمایش اکسیداز
- توجه داشته باشید در تست اکسیداز تغییر رنگ سواپ 20 تا 30 ثانیه بعد از زمان افزودن معرف ارزش تشخیصی ندارد.
- استفاده از میله فلزی (نیکل-کروم) در نتیجه آزمایش اکسیداز تداخل ایجاد کرده و نتیجه مثبت کاذب می دهد.
- سواپ ها و اپلیکاتورهای مصرف شده را بلافاصله در ظروف حاوی مواد ضدعفونی کننده قرار دهید.
- لاکتوز در مک کانکی آگار و ساکارز در TCBS کربوهیدرات های قابل تخمیر هستند که منجر به اسیدی شدن محیط می شود و اکسیداز منفی کاذب ایجاد می کند. بنابراین ، آزمایش اکسیداز باید از 5٪ آگار خون گوسفند یا محیط دیگر بدون قند قابل تخمیر انجام شود.
برای یادگیری تست اکسیداز و سایر تکنیک های مورد نیاز برای آزمایشگاه میکروبیولوژی
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.
بیشتر بخوانید:
سلام چرا باید کلنی ها یا محیط کشت کمتر از ۲۴ ساعت باشه . چرا نمیشه از محیط کشت کهنه استفاده کرد ؟
با سلام
زمان بررسی تغییر رنگ اهمیت زیادی دارد(علت این موضوع ناپایدار بودن آنزیم و سریع از بین رفتن آن است) و استفاده از ارگانیسم دارای اکسیدازِ با کلونی جوان نتایج دقیق تری خواهد داشت بنابراین می توان از محیط کشت کهنه نیز استفاده کرد اما برای بدست آوردن نتایج بهتر، اولویت با کلونی جدیدتر است.
چرا در تست اکسیداز نباید از محیط های کشت رنگی مثل محیط مک کانکی استفاده کنیم؟
محیط کشت مک کانکی به دلیل داشتن کربوهیدرات های قابل تخمیر که منجر به اسیدی شدن محیط می شود باعث ایجاد نتایج اشتباه از جمله اکسیداز منفی کاذب می شود.