مهندسی ژنتیک در گیاهان؛ کلونینگ ژن های دلتا اندوتوکسین
سال 1953 ساختمان سه بعدی DNA توسط واتسون و کریک کشف شد. این ساختمان نسبتا ساده این امکان را فراهم کرد، تا از آن پس دانشمندان سیستم های مختلف ژنتیکی را بررسی کرده و از این اطلاعات استفاده کنند. به مرور دانشمندان تلاش کردند تا یک DNA را از یک موجود گرفته و در موجود دیگری وارد کنند تا اثرات آن ژن در موجود ثانویه بروز کند.
دانش مهندسی ژنتیک از حدود ۱۶۰ سال پیش با کشف قوانین وراثت صفات زیستی، آغاز گردید، مهندسی ژنتیک، به عنوان بخشی از دانش بیوتکنولوژی؛ به مجموعه روشهایی گفته میشود که به منظور جداسازی، خالصسازی، واردکردن و بیان یک ژن خاص در یک میزبان بکار میروند و نهایتاً منجر به بروز یک صفت خاص یا تولید محصول مورد نظر در جاندار میزبان میشود. کاربردهای مهندسی ژنتیک تقریبا نامحدود به نظر میرسد.
آیا می دانید قدیمی ترین نوع بیوتکنولوژی در جهان چیست؟
کشاورزی یا به طور اختصاصیتر کشت گیاهان، قدیمیترین نوع بیوتکنولوژی در جهان میباشد که قدمت آن به 10000 سال پیش بر میگردد. در طی این مدت، انسان همواره در جستجوی انواع بهبودیافتهی محصولات خود بوده است، یعنی انواعی باکیفیت غذایی بهتر، بازده محصولی بیشتر و یا ویژگیهایی که در کاشت و برداشت سودمند باشند. کلونینگ ژنها بعد جدیدی را در پرورش محصولات کشاورزی از طریق تغییرات مستقیم ژنوتیپ گیاهان به وجود آورده است که توانسته بر پروسههای تصادفی تولیدمثل قدیمی پیشی بگیرد. از دو استراتژی کلی برای این منظور استفاده میشود.
- اضافه کردن ژن: که در آن از کلونینگ ژنها و اضافه کردن یک یا چند ژن برای تغییر خواص گیاهان استفاده میشود.
- حذف ژن: که در آن از تکنیک های مهندسی ژنتیک برای غیرفعال کردن یک یا چند ژن موجود در گیاه استفاده میشود.
روش اضافه کردن ژن در مهندسی ژنتیک در گیاهان
اضافه کردن ژن شامل تکنیکهای کلونینگ برای واردکردن یک یا چند ژن کدکننده ی خصوصیات مفید در گیاهی است که فاقد آنهاست. یک مثال خوب، ایجاد مقاومت به حملات حشرات است که به کمک ورود ژنهایی انجام شد که آفتکش تولید میکردند.
مهندسی ژنتیک؛گیاهانی که آفتکش موردنیاز خود را میسازند
گیاهان تقریباً غذای همهی انواع موجودات زنده یعنی ویروسها، باکتریها، قارچها و حیوانات هستند، اما شدیدترین مشکلات در کشاورزی ناشی از حشرات میباشد. برای کاهش خسارت، محصولات کشاورزی بهطور منظم سمپاشی میشوند. اکثر آفتکشهای سنتی مانند پیرتروئیدها و ارگانوفسفات ها تقریباً غیراختصاصی عمل میکنند بهطوری که نه فقط حشرهای که محصولات را میخورد بلکه طیف وسیعی از حشرات را میکشند.
از طرفی این حشرهکشها به دلیل سمیت بالایی که دارند برای بسیاری اعضای زمین ازجمله انسانها عوارض جانبی را به همراه دارند. همچنین نیاز به سم پاشی بر سطح گیاهان این مشکلات را دوچندان می کند زیرا در این صورت ورود این مواد شیمیایی به داخل اکوسیستم خارج از کنترل خواهد بود. علاوه بر این حشراتی که درون گیاهان و یا سطح زیرین برگ گیاهان زندگی می کنند، گاهی اوقات از گزند این آفت کش ها در امان می مانند. این عافت کش ها فقط باید علیه حشره ی آفت موثر باشد و طوری اختصاصی عمل کند که برای سایر حشرات و حیوانات و انسان سمیت نداشته باشد.
همچنین باید بتواند در محیط تجزیه شود و مقداری که از آن پس از برداشت محصول باقی می ماند و یا در اثر باران به داخل زمین می رود، نباید مدت زیادی در محیط باقی بماند تا به محیط زیست آسیب برساند، و آخر اینکه بهتر است این امکان وجود داشته باشد که آفت کش به همه ی بخش های گیاه و نه فقط سطح رویی آن برسد. چنین حشره کش ایده آلی هنوز کشف نشده است، اما نزدیک ترین نوع آن دلتا اندوتوکسین می باشد که به وسیله ی باسیلوس تورینژنسیس تولید می شود.
مهندسی ژنتیک؛دلتا اندوتوکسین باسیلوس تورینژنسیس
حشرات فقط از گیاهان تغذیه نمی کنند بلکه باکتری ها هم گه گاه بخشی از رژیم غذایی آن ها را تشکیل می دهند. در مقابل آن بسیاری از باکتری ها هم مکانیسم های دفاعی را علیه حشرات در خود به وجود آورده اند. به طور مثال باکتری باسیلوس تورینژنسیس در طی اسپورولاسیون خود اجسام کریستالی درون سلولی را تولید می کند که خاصیت آفت کشی دارند و دلتا اندوتوکسین نام دارند.
فرم فعال ذاین پروتئنی برای حشرات بسیار سمی می باشد و در بعضی موارد تا 80000 هزار بار از بعضی آفت کش ها مانند ارگانوفسفات ها سمی ترند و نسبتا اختصاصی عمل می کنند. سویه های مختلف این باکتری پروتئین هایی را می سازند که علیه لارو گروه های مختلفی از حشرات عمل می کنند. دلتااندوتوکسینی که در باکتری تجمع می یابد، یک فرم پیشتاز است.
بعد از این که پروتئین توسط حشره هضم شد، این پروتئین به وسیله ی پروتئاز برش خورده و پروتئین کوچکتری ایجاد می شود که خاصیت سمی دارد. این پروتئین به داخل معده حشره می چسبد و باعث آسیب به سطح اپی تلیومی آن می شود. در نتیجه حشره قادر به غذا خوردن نمی باشد و گرسنگی منجر به مرگ آن می شود. احتمال تنوعی که در جایگاه اتصال این سموم در حشرات وجود دارد، باعث اختصاصیت بالای انواع دلتا اندوتوکسین ها شده است.
سم باسیلوس تورینژنسیس کشف جدیدی محسوب نمی شود، اولین ثبت اختراع برای استفاده از آن به عنوان محافظت از محصولات کشاورزی، به سال 1904 بر می گردد. در طی سالیان متمادی، تلاش های زیادی برای تجاری سازی آن به عنوان آفت کش های دوستدار طبیعت شده است؛ اما خاصیت زیست تخریبی پذیری که دارد محبوبیت آن را کاهش داده است.
زیرا باید به طور مکرر در طی رشد محصول استفاده شود و این هزینه کشاورزی را افزایش خواهد داد. بنابراین تحقیقاتی صورت گرفت تا نیازی به استفاده ی مکرر آن نباشد. یک روش با استفاده از مهندسی پروتئینی بود که ساختار توکسین را طوری تغییر می داد که پایدارتر شود. یک روش دیگر، مهندسی محصولات کشاورزی بود به نحوی که سم توسط خود گیاه ایجاد شود.
مهندسی ژنتیک؛کلونینگ ژن های دلتا اندوتوکسین در ذرت
ذرت یکی از محصولاتی است که به خوبی توسط آفت کش های سنتی محافظت نمی شود. یک آفت مهم، حشره ی حفاری کننده اروپایی (Ostrinia nubilialis) است که به وسیله تخم هایی که در سطح زیرین برگ می گذارد، درون گیاه ایجاد تونل می کند و بنابراین آفت در تماس با آفت کش های پاشیده شده بر سطح گیاه در امان می مانند. اولین تلاش برای مقابله با این آفت از طریق مهندسی گیاهان توسط بیوتکنولوژیست های کشاورزی در سال 1993 انجام شد که در اثر آن گیاه قادر بود خود دلتااندوتوکسین از نوع CryA(b) را بسازد.
پروتئین (CryA(b دارای 1155 اسیدآمینه است که ناحیه ای که دارای خاصیت سمی است بین اسیدآمینه های 29 تا 607 قرار دارد. بنابراین آن ها به جای اینکه ژن کامل را کلون کنند قطعه ای را ساختند که حاوی 648 کدون اول پروتئین بود و آن را وارد ذرت کردند. تغییراتی روی ژن انجام دادند، منجر به افزایش بیان ژن در گیاه ذرت شد. به طور مثال از کدون هایی در ژن مصنوعی استفاده کردند که توسط گیاه ذرت بیشتر قابل شناسایی بودند و همچنین میزان بازهای CG ژن را به 65 درصد رساندند.
در حالی که میزان CG در ژن اولیه 38 درصد بود. این ژن مصنوعی درون یک وکتور کاست بین یک پروموتر و سیگنال پلی آدنیلاسیون ویروس موزاییک گل کلم قرار داده شد؛ و به وسیله ی بمباران با ریز پرتابه ها پوشیده شده با DNA وارد جنین ذرت شد. سپس جنین ذرت را کشت داده تا به گیاه بالغ تبدیل شود و آن گاه با آزمون PCR روی DNA استخراج شده از گیاه و با استفاده از پرایمر ژن مصنوعی ساخته شده وجود ژن سم در گیاه را تایید کردند. قدم بعدی استفاده از یک آزمون ایمونولوژیک بود تا تشخیص دهیم که دلتا اندوتوکسین توسط گیاه ترانسفورم شده تولید می شود.
نتیجه این بود که ژن مصنوعی واقعا فعال است اما میزان سمی که توسط هر گیاه تولید می شود، متفاوت است و محدوده ای از 250-1750 نانوگرم از هر میلی گرم میزان کل پروتئین را شامل می شود. این تفاوت احتمالا به خاطر اثر موقعیتی بوده، بدین معنا که میزان بیان یک ژن کلون شده در یک گیاه و یا حیوان اغلب تحت تاثیر جایگاه دقیق جای گیری ژن در کروموزوم میزبان خواهد بود.
مهندسی ژنتیک؛کلونینگ ژن های دلتا اندوتوکسین در کلروپلاست
در حال حاضر پروژه های بسیاری در سرتاسر جهان توسط شرکت های بیوتکنولوژی با هدف بکارگیری روش های اضافه کردن یا حذف ژن برای بهبود محصولات کشاورزی، انجام می شود. در مطلب مربوط به کلونینگ ژن ها و آنالیز DNA در کشاورزی بخش اول چند نمونه از این پروژه ها را بررسی کردیم از جمله، روش اضافه کردن ژن در مهندسی ژنتیک گیاهان، گیاهانی که آفتکش موردنیاز خود را میسازند، دلتا اندوتوکسین باسیلوس تورینژنسیس، کلونینگ ژن ها دلتا اندوتوکسین در ذرت. در ادامه می پردازیم به کلونینگ ژن های دلتا اندوتوکسین در کلروپلاست
یکی از مسائل مطرح شده در مورد غلات این بود که شاید ژن های کلون شده در گیاهان اصلی به علف های هرز منتقل شوند. از نظر بیولوژیکی این مسئله غیر ممکن است زیرا گرده ای که توسط گیاه اصلی تولید می شود فقط قادر است تخمک همان گونه را بارور سازد، بنابراین انتقال یک ژن از محصول اصلی به گیاه هرز غیر ممکن است. با این حال، یک روش که می تواند چنین مسئله ای را کاملا غیر ممکن بسازد، قرار دادن ژن درون ژنوم کلروپلاست به جای هسته است. به همین خاطر، از آنجا که گرده ی گیاهان دارای کلروپلاست نیستند، ژن مورد نظر قادر به جابجایی از گیاه اصلی به علف هرز نمی باشد.
سنتز پروتئین دلتا اندوتوکسین در کلروپلاست های تراریخته، در یک آزمایش تجربی در گیاه تنباکو به اثبات رسیده است. برای این کار، از ژن (a2) Cry IIA استفاده کردند که پروتئین حاصل از آن طیف سمیت وسیع تری نسبت به توکسین های Cry IA دارد به طوری که لارو مگس های دو بال را هم علاوه بر پروانه ها می کشد. در باکتری باسیلوس تورینژنسیس ژن (a2) Cry IIA سومین ژن یک اپرون کوچک است. دو ژن ابتدایی اپرون، پروتئین هایی را کد می کنند که به تا خوردن و پردازش سم کمک می کنند.
یک مزیت استفاده از کلروپلاست به عنوان جایگاهی برای ژن نوترکیب این است که سیستم بیان ژن کلروپلاست هم همانند باکتری است(زیرا کلرو پلاست ها زمانی خود پروکاریوت های زنده ی مستقلی بودند) و قادر به بیان هر سه ژن در یک اپرون خواهد بود؛ اما اگر ژنی را بخواهیم در ژنوم هسته ی گیاه یا حیوان وارد کنیم، هر ژن باید به طور جدا با پروموتر و سیگنال های بیانی مخصوص به خود کلون شود که این مسئله بیان دو یا چند ژن در یک زمان را بسیار مشکل می سازد.
اپرون (a2) Cry IIA به ژن مقاومت کانامایسین به همراه توالی های DNA کلروپلاست مجاور متصل شد و سپس قطعه ی ساخته شده به کمک روش بیولیستیک وارد سلول های برگ گیاه تنباکو شد. همچنین دخول به درون ژن کلروپلاست توسط روش انتخابی مقاومت به کانامایسین تضمین شد؛ به این صورت که قطعاتی از برگ گیاه را درون آگار حاوی کانامایسین حدود 13 هفته قرار دادند. جوانه ای که از قطعات برگ بیرون زده بود را در محیطی دیگر وارد کردند که ریشه زایی را تحریک می کرد و بدین ترتیب گیاه کامل بدست آمد.
میزان پروتئین (a2) Cry IIA که تولید شده بود، بسیار قابل توجه بوده به طوری که حدود 45 درصد از میزان کل پروتئین محلول را تشکیل می داد که این مقدار بیشتر از روش های کلونینگ قبلی بود. این بیان بالای پروتئین به احتمال خیلی زیاد به خاطر تعداد بالای کپی های ژن (زیرا تعداد ژنوم کلروپلاست در سلول بسیار زیاد است در حالی که فقط دو عدد از کپی های ژنوم هسته وجود دارد) و حضور دو ژن کمک کننده ی دیگر اپرون در کلروپلاست است.
همان طور که پیش بینی می شد گیاه مورد نظر در برابر لاروهای حساس بسیار سمی شده بود. 5 روز بعد از آلوده کردن گیاهان با حشرات تمام کرم های غوزه پنبه و کرم مسلح چغندر کشته شده بودند و تنها آسیب بسیار کمی روی برگ گیاهانی که با کرم مسلح چغندر آلوده شده بودند دیده می شد که آن ها هم به خاطر مقاومت بالای طبیعی این کرم به دلتا اندوتوکسین است.
همچنین میزان بالای توکسین در بافت برگ ها اثری روی خود گیاهان نگذاشته بود، زیرا گیاهان تنباکوی مهندسی شده با گیاهان طبیعی از نظر فاکتور هایی مثل میزان رشد، مقدار کلروفیل و سطح فتوسنتز غیر قابل تمایز بودند. تلاش ها برای انجام همچنین روشی برای ذرت، پنبه و سایر محصولات کشاورزی مفید، به دلیل مشکلاتی که در ترانسفورماسیون کلروپلاست این گیاهان وجود دارد، با موانعی همراه بوده است.
مهندسی ژنتیک؛ مبارزه با حشرات مقاوم به محصولات تولید کننده ی دلتا اندوتوکسین
مدت طولانیست که مشخص شده است، محصولاتی که دلتا اندوتوکسین می سازند پس از مدتی بی اثر می شوند، زیرا حشراتی که از این محصولات تغذیه می کنند پس از مدتی به این توکسین مقاوم می شوند. این امر نتیجه ی طبیعی در معرض قرار گرفتن این حشرات با مقدار زیادی از توکسین است و بدین ترتیب بعد از چند سال دیگر گیاهان مهندسی شده نسبت به گیاهان معمولی برتری نداشتند.استراتژی های زیادی برای جلوگیری از ایجاد مقاومت در حشرات پیشنهاد شده است.
یکی از اولین استراتژی ها که پیشنهاد شد، ایجاد محصولاتی بود که در 2 ژن Cry II و Cry I را بیان کنند. با این منطق که چون این دو توکسین با هم متفاوت هستند، ایجاد مقاومت علیه هر دو سم در یک جمعیت حشرات بسیار غیر متحمل خواهد بود. یک راه دیگر می تواند این باشد که فرایند تولید سم را طوری تغییر دهیم که سنتز آن فقط در بخش نیازمند به محافظت در گیاه انجام شود. راه کار سوم این است که گیاهان دستکاری شده و گیاهان طبیعی را باهم در یک زمین زراعی کشت دهیم، چرا که حشرات می توانند از بعضی از گیاهان بدون در معرض قرار گرفتن با توکسین، تغذیه کنند.