مبانی الکتروفورز (دستگاه الکتروفورز و پارامترهای موثر)
در این مقاله آموزشی جامع قصد داریم تکنیک الکتروفورز، انواع روش ها و کاربرد آن ها در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی را مورد بررسی قرار دهیم.
اﺻﻄﻼح اﻟﮑﺘﺮوﻓﻮرز به معنی ﺣﺮﮐﺖ ﻫﻤﻪ ﺗﺮﮐﯿﺒﺎت ﯾﺎ ذرات ﺑﺎردار در ﯾﮏ ﻣﺤﻠﻮل (ﻣﺤﯿﻂ ﻣﺎﯾﻊ) ﺗﺤﺖ ﺗﺎﺛﯿﺮ ﺟﺮﯾﺎن اﻟﮑﺘﺮﯾﮑﯽ است. ﺗﺮﮐﯿﺒﺎت ﺷﯿﻤﯿﺎﯾﯽ دارای ﺑﺎر اﻟﮑﺘﺮﯾﮑﯽ با توجه به مثبت و یا منفی بودن بار، ﺑﻪ ﺳﻤﺖ ﻗﻄﺐ آﻧﺪ و ﯾﺎ ﮐﺎﺗﺪ حرکت می نمایند.
الکتروفورز، تکنیکی است برای جداسازی و شناسایی مولکول ها از طریق اعمال جریان الکتریکی است. الکتروفورز برای جداسازی مولکول های باردار مانند RNA ،DNA و پروتئین، در آزمایشگاه‌های مولکولی و بیوشیمی کاربرد دارد. با استفاده از تکنیک الکتروفورز قادر به شناسایی مولکول های DNA با طول های متفاوت هستیم.
عوامل موثر در ﺳﺮﻋﺖ ﺣﺮﮐﺖ ﺗﺮﮐﯿﺒﺎت ﻣﻮﺟﻮد در ﯾﮏ ﻧﻤﻮﻧﻪ در اﻟﮑﺘﺮوﻓﻮرز
1- بار الکتریکی خالص یون
2- اندازه و شکل یون
3- شدت میدان الکتریکی
4- خواص محیط پایه
5- دمای محیط الکتروفورزی
دﺳﺘﮕﺎه اﻟﮑﺘﺮوﻓﻮرز
1- دو ﺗﺎﻧﮏ ﺑﺎﻓﺮ ﮐﻪ ﺑﺎﻓﺮﻫﺎي اﻟﮑﺘﺮوﻓﻮرزي در آن رﯾﺨﺘﻪ ﻣﯽﺷﻮد
2- اﻟﮑﺘﺮودﻫﺎ
3- ﻣﺤﯿﻂ ﭘﺎﯾﻪ اﻟﮑﺘﺮوﻓﻮرزي (محیط پایه الکتروفورزی شامل ژل آگارز، استات سلولز، پلی آکریل آمید است)
4- ﺻﻔﺤﻪ ﭘﻮﺷﺎﻧﻨﺪه ﺟﻬﺖ ﺟﻠﻮﮔﯿﺮي از ﺗﺒﺨﯿﺮ
5- ﺳﯿﺴﺘﻢ ﺗﺎﻣﯿﻦ ﮐﻨﻨﺪه ﺟﺮﯾﺎن اﻟﮑﺘﺮﯾﮑﯽ یا منبع تغذیه(Power Supply)
6- ﺑﺎﻓﺮ(ﺗﺎﻣﭙﻮن)
علت اضافه کردن بافر در فرایند الکتروفورز
– عبور دادن جریان الکتریکی
– ثابت نگه داشتن pH محیط
– تعیین بار الکتریکی سطح ترکیب موجود در نمونه
برای یادگیری تکنیک الکتروفورز و سایر تکنیک های مورد نیاز برای آزمایشگاه ژنتیک مولکولی
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.
بیشتر بخوانید:
انواع روش ها و ژل های الکتروفورز
الکتروفورز به طور معمول به 2 روش افقی(horizontal) و عمودی(vertical) انجام می شود . از سوي دیگر براساس نوع محیط پایه و مواد شیمیایی مورد استفاده و همچنین نوع مکانیسم جداسازي, روش هاي الکتروفورزي تنوع زیادي پیدا کرده اند. ازجمله می توان انواع زیر را نام برد:
1- الکتروفورز بر روی ژل آگارز (AGE or Agarose Gel Electrophoresis)
2- الکتروفورز بر روی استات سلولز (CAE or Cellulose Acetate Electrophoresis)
3- الکتروفورز بر روی ژل پلی آکریل امید (PAGE or Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
ژل آگارز
آگارز به شکل پودر سفید است که به آن آب جوش اضافه می گردد، و هنگامی که سرد می شود حالت ژله ای به خود می گیرد. برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگارز استفاده می شود. تهیه ژل مزبور به مراتب سریعتر و آسانتر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری را در بر می گیرد. معمولا برای تفکیک قطعات بزرگ DNA (بزرگتر از ۵۰۰ جفت باز) در صورتیکه هدف صرفا بررسی کیفی و تفکیک باشد استفاده از ژل آگارز انتخاب اول است. برای تفکیک قطعاتی به اندازه ۱۰۰جفت باز از آگارز ۳ %و برای قطعات حدود ۲۰۰۰ جفت باز از آگارز ۸ %درصد استفاده می شود.
اﻧﺪازه ﺣﻔﺮه ﻣﻮﺟﻮد در ژل، ﺑﺴﺘﮕﯽ ﺑﻪ ﻏﻠﻈﺖ آﮔﺎرز در ﺑﺎﻓﺮ دارد .ﻫﺮ ﺑﺎﻧﺪ ﺗﻔﮑﯿﮏ ﺷﺪه ﺣﺎوي ﭼﻨﺪﯾﻦ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ ﺑﺎ ﺣﺮﮐﺖ اﻟﮑﺘﺮوﻓﻮرزي ﯾﮑﺴﺎن ﻣﯽﺑﺎﺷﺪ. در اﯾﻦ ﻧﻮع از ﻣﺤﯿﻄ هاي اﻟﮑﺘﺮوﻓﻮرزي ﺑﺎﻧﺪﻫﺎ ﺑﯿﺸﺘﺮ ﺑﻪ ﺻﻮرت ﭘﻬﻦ دﯾﺪه ﻣﯽﺷﻮﻧﺪ زﯾﺮا ژل آﮔﺎرز ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﻣﺤﯿﻄ های دﯾﮕﺮ ﻣﺎﻧﻨﺪ اﺳﺘﺎت ﺳﻠﻮﻟﺰ ﻧﺴﺒﺖ ﭘﺮوتئین ها از ﻧﻔﻮذﭘﺬﯾﺮي ﺑﺎﻻﯾﯽ ﺑﺮﺧﻮردار ﻣﯽﺑﺎﺷﺪ.
پروتکل/دستوالعمل تهیه ژل آگارز
استات سلولز
کاغذها بیشتر از این حائز اهمیت هستند که جنبه جداسازي ترکیبات با وزن مولکولی پایین را دارند. مزیت اصلی این محیط ها نازك بودن و قدرت مکانیکی آنهاست. این محیط ها حساسیت زیادی دارند، زیرا به نمونه کمتري براي باندهاي قابل تشخیص نیاز دارند. استات سلولز بوسیله قرار دادن کاغذ سلولز در مجاورت انیدرید استیک ایجاد می گردد که گروه استیل بر روي گروه هاي هیدروکسیل قند قرار می گیرد.
ژل پلی آکریل آمید
ژل پلی آکریل آمید در برابر حرارت پایدار بوده و شفاف است و همچنین فاقد بار الکتریکی می باشد به همین دلیل تداخلی که در ژل آگارز وجود داشت در اینجا وجود ندارد. به دلیل سرطان زا بودن باید دقت کافی را داشت تا با پوست دست تماس پیدا نکند.
نحوه ی آماده سازی این ژل به گونه ای ست که با تغییر میزان پودر، منافذ موجود در ژل تغییر می کند. اکریل آمید برای جداسازی پروتئین هایی با اندازه ی 5 تا 2000 کیلو دالتون است. برای ساخت این ژل از آب مقطر، محلول اکریل آمید، Tris ،SDS استفاده می شود . در اینجا ما دو عدد شیشه داریم که این محلول باید بین این دو ریخته شود. هنگام ریختن ژل با مراقب باشیم حباب هوا ایجاد نشود. سپس شانه را درون ژل قرار می دهیم.
پروتکل تهیه ژل پلی آکریل امید
رنگ آمیزي ژل های الکتروفورزي (Staining)
دلیل رنگ آمیزي ژل های الکتروفورزي، آشکار شدن جایگاه باندهاي پروتئین و … است. انتخاب رنگ ها با توجه به نوع ژل و نوع ترکیب مورد جداسازي صورت می گیرد. میزان رنگ هر باند با میزان پروتئین موجود در آن باند ارتباط دارد ولی این میزان تحت تاثیر عوامل دیگري نظیر نوع پروتئین و میزان دناتوراسیون آن قرار می گیرد. وقتی از رنگ آمیزي پروتئین ها استفاده می شود بخش لیپیدي لیپوپروتئین ها یا کربوهیدراتی گلیکوپروتئین ها رنگ نمی شود. لذا مقادیر آنها کمتر از میزان واقعی برآورد خواهد شد.
رنگ های مورد استفاده برای انواع ژل
1- پروتئین: آمیدو بلک، کوماسی بریلیانت بلو و نیترات نقره
2- لیپوپروتئین: سودان بلک، کوماسی بریلیانت بلو و Oil Red
3- گلیکوپروتئین: Periodic Acid Schiff (PAS)
4- اسیدهای نوکلئیک : اتیدیوم بروماید و نیترات نقره
5- دهیدروژناز : NADH(داراي خاصیت فلوئورسان) و نمک تترازولیوم
برای دریافت خدمات مربوط به تکنیک الکتروفورز و انجام انواع تست های ژنتیک مولکولی
از طریق لینک خدمات آزمایشگاهی می توانید اقدام نمایید
بیشتر بخوانید
