اندازه گیری غلظت DNA و RNA با دستگاه نانودراپ
برای مراکز تحقیقاتی و تشخیصی که تقاضای بالایی برای تجزیه و تحلیل کیفیت نمونه ها دارند، این دستگاه یک راه حل مقرون به صرفه است و با استفاده از آن، در مدت زمان بسیار کوتاهی با حجم بسیار کم از نمونه نتایج را می توان بدست آورد.
نانودراپ، اسپکتروفتومتر بدون نیاز به کووت است و تنها با استفاده از 1 الی 2 میکرولیتر از نمونه قادر است در زمانی کمتر از 10 ثانیه کلیه طول موج های موجود در طیف مورد نظر را با دقت 1 نانومتر، اسکن نماید و غلظت یا جذب نوری ماده مورد نظر را نیز تعیین کند.
از سال 2001، بیش از 35000 ابزار NanoDrop در آزمایشگاه‌های دانشگاهی، تحقیقاتی، تجاری و QC با تمرکز در زمینه‌های متنوعی مانند ژنومیک، پروتئومیکس، کشف دارو، تشخیص مولکولی و تولید زیستی مورد استفاده قرار گرفته است. این سیستم به دانشمندان اجازه می دهد تا به سرعت و به راحتی خلوص نمونه هایی مانند پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک را ارزیابی کنند.
برای هر آزمایشگاهی که با نمونه‌های بیولوژیکی سر و کار دارد، ابزارهای NanoDrop به دلیل سرعت، سادگی و ماهیت قوی، مورد استفاده قرار می گیرند. نانودراپ در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی جهت تعیین غلظت اسید های نوکلئيك به کار می رود اما از این دستگاه برای اندازه گیری دانسیته(چگالی) سلول ها و غلظت پروتئین ها استفاده می شود.
برای دریافت خدمات مربوط به تعیین میزان غلظت و خلوص اسیدهای نوکلئیک(خوانش OD)
از طریق لینک خدمات آزمایشگاهی می توانید اقدام نمایید
اسپکتروفتومتر نانودراپ شامل مدل های uv-vis و فلورسانس می باشد.
مدل های uv-vis شامل: NanoDrop 2000 ،NanoDrop 2000c ،NanoDrop one ،NanoDrop one c.
مدل های فلورسانس شامل: NanoDrop 3300
اساس کار شکست نور و محاسبات حاصل از بررسی ضرایب شکست نور در محیط مایع برای مواد گوناگون به ویژه اسیدهای نوکلئیک و پروتئین ها می باشد.
کاربردهای نانودراپ(Nanodrop applications)
• توانایی آن در اندازه گیری CyDye واقع شده به درون پروب های ریز آرایه
• مورد استفاده برای بررسی کیفیت پروب
• روشی استاندارد در محیط آزمایشگاهی
• قابلیت آنالیز تعداد بالایی از نمونه ها در یک بازه ی زمانی نسبتا کوتاه
• توانایی اسکن نمونه ها در سراسر طیف ۲۲۰ تا ۷۵۰ نانومتر
• سهولت برای اندازه گیری DNA و RNA
بیشتر بخوانید:
نکته ای که باید در نظر گرفته شود این است که DNA و RNA هر دو در 260 نانومتر جذب می شوند. بنابراین، اگر یک نمونه RNA دارید که تحت تاثیر DNase قرار نگرفته است، غلظت آن ممکن است تحت تأثیر DNA آلوده قرار گیرد. تنها راه برای بدست آوردن قرائت دقیق در این مورد استفاده از روش های فلورمتری مانند کیوبیت است که می تواند به طور خاص کمیت اسیدهای نوکلئیک را تعیین کند.
دلیل اصلی استفاده از نانودراپ، استنباط خلوص نمونه ها است. که به طور کلی در دو نسبت نشان داده شده است: 260/280 و 260/230. این اعداد مربوط به جذب در طول موج های 230، 260 و 280 نانومتر است.
توجه داشته باشید که منحنی ارائه شده توسط نانودراپ می تواند بسیار آموزنده باشد بنابراین فقط روی نسبت ها تمرکز نکنید. در منحنی باید یک پیک خوب در 260 نانومتر وجود داشته باشد که نشان دهنده وجود اسیدهای نوکلئیک است و هیچ قله ای در جای دیگر وجود ندارد. اگر پیک های دوگانه یا جابجایی در منحنی وجود داشته باشد، اینها علائم هشدار دهنده حیاتی هستند که نشان می دهد نمونه خالص نیست.
نسبت 260/280
نسبت 260/280 نشان دهنده میزان خالص بودن نمونه از آلودگی پروتئینی است. از آنجایی که پروتئین ها در 280 نانومتر جذب می شوند، نسبت کم 260/280 نشان دهنده وجود مقادیر بالای پروتئین نسبت به اسیدهای نوکلئیک است.
نسبت بهینه 260/280
نسبت بهینه 260/280 به نوکلئیک اسیدی که اندازه گیری می کنید بستگی دارد:
DNA: 1.80
RNA: 2.00
دلیل اینکه نسبت RNA خالص کمی بیشتر از DNA است، افزایش حضور بازهای اوراسیل (U) است. بنابراین، نسبت 260/280 همچنین می تواند نشان دهنده این باشد که کدام اسید نوکلئیک غالب است.
برای بهبود نسبت های 260/280، بهترین کار این است که به عقب برگردیم و پروتئین های آلوده را حذف کنیم. بنابراین، استفاده بیشتر از آنزیم های پروتئیناز K و انکوباسیون در طول شب می تواند کمک کننده باشد. پس از تمیز کردن مجدد نمونه ها، نسبت 260/280 ممکن است درست شود، اما ممکن است مقداری از اسیدهای نوکلئیک را از دست بدهیم. از طرف دیگر، اگر نمونه دارای غلظت کمی از اسیدهای نوکلئیک برای شروع باشد، شاید بهتر باشد به منبع (به عنوان مثال سلول ها، بافت) برگردید و کل نمونه را مجدد استخراج کنید.
نسبت 260/230
نسبت 260/230 مقداری است که نشان دهنده خلوص نمونه از نمک ها و سایر آلاینده هایی است که می توانند در 230 نانومتر جذب شوند. نمونه هایی از این آلاینده ها عبارتند از EDTA، فنل و گوانیدین هیدروکلراید.
نسبت بهینه 260/230
نمونه های اسید نوکلئیک خالص دارای نسبت 260/230 2 یا بالاتر هستند. هر چیزی کمتر از 2 نشان می دهد که عوامل دیگری در نمونه وجود دارد.
اگر نسبت 260/230 کم باشد، بهتر است نمونه ها را با استفاده از ستون های چرخشی یا رسوب دهی مجدد تمیز کنیم. افزودن مراحل شستشوی بیشتر در طول این فرآیندها می تواند به حذف آلودگی ها کمک کند. با این حال، انجام این کار همچنین می تواند منجر به از دست دادن مقداری اسید نوکلئیک شود. اما، از دست دادن مقدار کمی برای نمونه های خالص ارزش آن را دارد.
آلاینده های موجود در نمونه های اسید نوکلئیک
پروتئین یک آلاینده قابل توجه و اغلب در آماده سازی اسید نوکلئیک است. پروتئین به جذب در 260 نانومتر کمک می کند و به طور مصنوعی غلظت اسید نوکلئیک را افزایش می دهد و با توجه به کاهش نسبت خلوص 260/280 شناسایی می شود.
شکل 1. DNA خالص و طیف پروتئین خالص روی یک نمودار قرار گرفته اند. طیف DNA (سبز آبی) دارای پیک مشخص در 260 نانومتر و فرورفتگی در 230 نانومتر است، در حالی که، طیف پروتئین (قرمز-آبی) دارای پیک مشخص در 280 نانومتر و افزایش جذب زیر 250 نانومتر است.
کاهش این نسبت به دلیل وجود بقایای اسید آمینه (تیروزین، تریپتوفان و فنیل آلانین) و پیوندهای دی سولفید سیستین در پروتئین در طول موج 280 نانومتر جذب می شود (شکل 1).
خوانش یا تعیین OD با نانودراپ و تفسیر نتایج
در تفسیر نتایج نانودراپ مهم ترین عوامل موثر به شرح زیر است:
آلودگی با پروتئین
غلظت 260 به 280 پائین تر از 1/8 عموماً نشان دهنده آلودگی پروتئین در طی مراحل استخراج می باشد. یکی از مشکلات در استخراج RNA و DNA حذف ناکامل پروتئین ها از عصاره سلولی می باشد. پروتئین جذب در طول موج 280 را افزایش می دهد، بنابراین نسبت 260 به 280 کاهش می یابد و خلوص RNA کمتر می شود.
آلودگی با پلی ساکارئید ها
برای نمونه های RNA و DNA نسبت 260 به 230 باید بالاتر از 2 و کمتر از 2/4 باشد. نسبت 260 به 230 پایین تر نشان دهنده آلودگی به پلی ساکارئید ها می باشد.
آلودگی با نمک ها
نسبت جذب 260 به 240 برای اسیدهای نوکلئیک خاص باید حدود 1/4 باشد، این نسبت برای تعیین مقدار نمک ها به کار می رود. وقتی نسبت جذب 260 به 240 کمتر از 1/4 باشد، اسیدهای نوکلئیک باید چند بار با اتانول 70 درصد و در نهایت با اتانول 95 درصد شستشو شوند.
بیشتر بخوانید:
