روش های سنجش غلظت و خلوص اسیدهای نوکلئیک(DNA و RNA) – تعیین OD
پس از استخراج اسیدهای نوکلئیک مورد نظر برای اطمینان از کیفیت نمونه ها، باید غلظت آن ها را مورد بررسی و سنجش قرار دهیم که به تعیین میزان غلظت و خلوص اسیدهای نوکلئیک به اصطلاح خوانش OD یا تعیین OD گفته می شود.
روش اسپکتوفتومتری
برای تعیین غلظت اسیدهای نوکلئیک استخراج شده استفاده از روش اسپکتوفتومتری می گردد و آن گرفتن جذب نوری نمونه ها در اسپکتوفتومتری است. دستگاهی که میزان جذب نوری ترکیبات را می سنجد نیز اسپکتروفوتومتر نامیده می شود.
در این روش بر اساس مقدار جذب نوری در طول موج های خاصی از اشعه گاما می توان مقدار دقیق DNA یا RNA و درصد خلوص آن ها را در نمونه تعیین کرد.از این روش به طور متداول برای تعیین خلوص و مقدار اسید نوکلئیک در نمونه ها استفاده می شود.
اسپکتروفتومترها این امکان فراهم می کنند که خلوص را به همراه غلظت اندازه گیری کنید. خلوص DNA با نسبت جذب در 260 نانومتر به 280 نانومتر ارزیابی می شود. اسپکتروفتومترها با استفاده از فرمول زیر غلظت اسید نوکلئیک را محاسبه می کنند:
غلظت =(µg/ml) A260 خواندن ضریب تبدیل
ضریب تبدیل 50 میکروگرم بر میلی لیتر برای dsDNA، برای RNA حدود 40 میکروگرم بر میلی لیتر و 33 میکروگرم بر میلی لیتر برای ssDNA است.
فراموش نکنید که اگر قبل از اندازه گیری نمونه های خود را رقیق کرده اید، باید غلظت را با ضریب رقت خود ضرب کنید.
هنگامی که غلظت نمونه خود را می دانید ، می توانید عملکرد آن را محاسبه کنید، به عنوان مثال. برای تعیین اینکه آیا واکنش PCR شما مقدار کافی اسید نوکلئیک ایجاد کرده است یا خیر
بازده (µg) = غلظت x حجم نمونه کل (میلی لیتر)
قانون بیر-لامبرت
اجازه می دهد تا غلظت اسیدهای نوکلئیک در یک نمونه بر اساس میزان نور جذب شده در ۲۶۰ نانومتر محاسبه شود:
A = εbc
A جذب به عنوان چگالی نوری نیز شناخته می شود
ε ضریب خاموشی
b طول مسیر Cuvette نمونه
c غلظت ترکیب در یک محلول است
از اسپکتروفتومتری نیز می توان برای تعیین خلوص نمونه استفاده کرد. نسبت A260/A280 را برای تشخیص آلودگی پروتئینی(و آلودگی RNA در مورد نمونه های DNA) و نسبت A260/A230 را برای تشخیص آلودگی با نمک های شوتروپیک، EDTA، شوینده های غیر یونی، پروتئین ها و فنل محاسبه کنید.
dsDNA خالص دارای نسبت A260/A280 از 1.85-1.88 و RNA خالص حدود 2.1 است. نسبت A260/A230 معمولاً بیشتر از نسبت A260/A280 است و معمولاً بین 2.3-2.4 برای dsDNA و 2.1-2.3 برای RNA است.
اسپکتروفتومترها این امکان را فراهم می کنند که خلوص را به همراه غلظت اندازه گیری کنید. خلوص DNA با نسبت جذب در 260 نانومتر به 280 نانومتر ارزیابی می شود. DNA با کیفیت بالا باید دارای نسبت A260/A280 از 1.7 به 2.0 باشد. سایر آلاینده های احتمالی مانند نمک یا فنول در 230 نانومتر اندازه گیری می شوند. نسبت A260/A230 باید بیشتر از 1.5 باشد.
غلظت (µg/ml) = (خواندن A260 – خواندنA320) factor ضریب رقت × 50 µg/ml
بازده کل نیز با ضرب غلظت DNA در حجم کل نمونه خالص نهایی به دست می آید.
بازده= DNA (µg) غلظت × DNA volume حجم کل نمونه (ml)
نانودراپ
ساخت دستگاه نانو دراپ یکی دیگر از پیشرفت هایی است که در زمینه دستگاه های اسپکتوفتومتری صورت گرفته است. از ویژگی های شاخص این دستگاه سرعت پردازش بالای آن و همچنین توانایی اندازه گیری طیف مرئی و UV است.
تعیین غلظت DNA با نانودراپ(خوانش OD یا چگالی نوری)
برای اندازه گیری، فقط به 1 میکرولیتر از نمونه مورد نیاز است. همچنین در اندازه گیری به این روش به وسایل دیگری به جزء سر میکروپیپت(سر سمپلر)نیازی نیست. نانودراپ برای اندازه گیری غلظت پروتئین و رنگ های فلورسنت نیز بکار می رود.
یکی از قابلیت های این دستگاه این است که بدون نیاز به کووت و فقط با استفاده از 1 الی 2 میکرولیتر از نمونه می تواند در کمتر از 10 ثانیه کلیه طول موج هایی که در طیف مورد نظرموجود است را با دقت 1 نانومتر، اسکن نماید و غلظت یا جذب نوری ماده مورد نظر را نیز تعیین کند.
با توجه به سرعت بسیار بالای دستگاه و میزان کم نمونه مصرفی، این امکان را به کاربران می دهد که ضمن صرفه جویی در زمان و هزینه، تعداد زیادی از آزمایشات پروتئومیکس، ژنومیکس و بیوشیمی را کنترل کیفی را بهینه نمایند.
جذب در طول موج 260 نانومتر اطلاعات زیادی را در زمینه خلوص و کیفیت نمونه ایجاد نمی کند. اگر آلودگی پروتئینی، آلودگی به حلال های آلی و نمک ها و کربوهیدرات ها وجود داشته باشد، میزان جذب به طور چشمگیری تغییر می کند.
محاسبه فلورومتری
روشی است که برای شناسایی و تعیین کمی آنالیت ها در یک نمونه با افزودن فلوروفورهایی که به آنالیت مورد نظر به نمونه متصل می شوند، آنها را با پرتویی از اشعه ماوراء بنفش تحریک می کند و طول موج ساطع شده را تشخیص و اندازه گیری می کند.
برخلاف اسپکتروفتومتری، فلورومتری نیاز به تنظیم سنجش دارد. این بدان معناست که شما باید یک کیت سنجش مناسب برای نمونه خود که شامل رنگ فلورسنت، بافر و استانداردها تهیه کنید. هنگام تهیه نمونه های خود، دستورالعمل دقیق استفاده از کیت را بررسی کنید تا مطمئن شوید که رنگ فلورسنت به اسیدهای نوکلئیک و استانداردها متصل است.
قبل از شروع اندازه گیری های خود بر روی فلورومتر، باید دستگاه را با خواندن لوله های PCR با استانداردها کالیبره کنید. استاندارد اول باید غلظت 0 نانوگرم در میلی لیتر و آخرین استاندارد حداکثر غلظت محدوده سنجش شما را نشان دهد. پس از کالیبراسیون فلورومتر با ایجاد منحنی استاندارد، می توانید لوله های PCR حاوی نمونه های خود را یکی پس از دیگری اضافه کنید.
برای انجام اندازه گیری فلورسانس به فلورومتر و کیت سنجش نیاز دارید. فلورومترها معمولاً غلظت اسید نوکلئیک را محاسبه می کنند. در غیر این صورت، می توانید آن را با مقایسه فلورسانس نمونه خود با منحنی استاندارد محاسبه کنید. در مورد اسپکتروفتومتری، فراموش نکنید که غلظت بدست آمده را با ضریب رقت ضرب کرده و با ضرب غلظت در حجم کل نمونه ، عملکرد را محاسبه کنید.
مقایسه روش اسپکتوفوتومتری(طیف سنجی) و فلورومتری
همانطور که توضیح دادیم ، فلورومترها نمی توانند خلوص نمونه های اسید نوکلئیک را اندازه گیری کنند، فقط غلظت آنها را اندازه گیری می کنند. نقطه ضعف دیگر آن ها نسبت به اسپکتروفتومتری این است که هزینه بالایی دارند. زیرا کیت های سنجش گران هستند و زمان بیشتری باید برای این کار صرف شود، قبل از تجزیه و تحلیل باید نمونه های خود را با رنگ فلورسنت مخلوط کنید.
از مزایای آن نسبت به اسپکتروفتومتری این است که دارای حساسیت بالایی است و با نمونه های رقیق شده نتایج بهتری را ارائه می دهد، به عنوان مثال پس از استخراج اسید نوکلئیک حد پایین تشخیص اسپکتروفتومتر NanoDropTM 0.4 نانوگرم بر میکرولیتر است، در حالی که فلورومتر Qubit دارای محدودیت تشخیص کمتر از 0.005 نانوگرم بر میکرولیتر است.
پس از انجام PCR، معمولاً هم حساسیت و هم برآورد بیش از حد غلظت مشکل ایجاد نمی کند، زیرا به هر حال تعداد بسیار زیادی از بخش اسید نوکلئیک مورد نظر را دارید و این بدان معناست که اسپکتروفتومتری روش متداول پس از واکنش PCR است، مگر اینکه نیاز به تعیین غلظت بسیار دقیق تری داشته باشیم.
به عنوان مثال اگر در پایین دست کار شما توالی یابی نسل بعدی (NGS) مد نظر باشد، برای سنجش NGS ، می توانید تا 96 نمونه را برای تجزیه و تحلیل آنها در یک مرحله جمع آوری کنید، نکته مهم این است که حتما نمونه ها باید غلظت یکسانی داشته باشند تا بتوانیم نتایج مطلوبی بدست آوریم.
خلوص اسیدهای نوکلئیک با فلورومتری قابل محاسبه نیست زیرا فقط فلوروفورهای متصل شونده به اسیدهای نوکلئیک را تشخیص می دهد، بنابراین نمی تواند آلاینده ها را تشخیص دهد.
همانطور که توضیح داده شد، برای انجام اندازه گیری فلورسانس به فلورومتر و کیت سنجش نیاز داریم. اگر نمونه های زیادی برای تجزیه و تحلیل دارید، می توانید از دستگاه خواننده میکروپلیت(الایزا ریدر) استفاده کنید که می تواند فلورسانس را با یک رایانه اندازه گیری کند. تفاوت در تنظیم سنجش در این است که شما نمونه ها و استانداردهای خود را به جای لوله های PCR در یک میکروپلیت اضافه می کنید و سپس فلورسانس کل صفحه را در یک حرکت اندازه گیری می کند.
برای بررسی موفقیت آمیز بودن استخراج اسید نوکلئیک و واکنش های PCR و تعیین خلوص و غلظت نمونه های اسید نوکلئیک، معمولاً باید از روش های ترکیبی استفاده کنید. الکتروفورز ژل و اسپکتروفتومتری برای اکثر نمونه ها کاربردی و مناسب است اما اگر با نمونه های رقیق کار می کنید یا نیاز به اندازه گیری غلظت بسیار دقیق برای برنامه های پایین دست مانند NGS دارید ، ممکن است فلورومتر نیز لازم باشد، و حتی می توانید TapeStation را دو برابر کرده و نتایج را بررسی کنید.
بیشتر بخوانید:
تعیین کننده خلوص اسیدهای نوکلئیک
نسبت جذب 260 به 280 و نسبت 260 به 230 تعیین کننده خلوص اسیدهای نوکلئیک استخراج شده می باشد. آلودگی با اسیدهای نوکلئیک مختلف بر اندازه گیری غلظت تأثیر می گذارد زیرا آنها نیز در طول موج یکسان جذب می شوند.
برای نمونه های RNA نسبت 260 به 280 برابر 1±2 و برای نمونه های DNA نسبت 260 به 280 برابر 1± 8/1 قابل قبول است.
آلودگی با پروتئین
غلظت 260 به 280 پائین تر از 1/8 عموماً نشان دهنده آلودگی پروتئین در طی مراحل استخراج می باشد. یکی از مشکلات در استخراج RNA و DNA حذف ناکامل پروتئین ها از عصاره سلولی می باشد. پروتئین جذب در طول موج 280 را افزایش می دهد، بنابراین نسبت 260 به 280 کاهش می یابد و خلوص RNA کمتر می شود.
آلودگی با پلی ساکارئید ها
برای نمونه های RNA و DNA نسبت 260 به 230 باید بالاتر از 2 و کمتر از 2/4 باشد. نسبت 260 به 230 پایین تر نشان دهنده آلودگی به پلی ساکارئید ها می باشد.
آلودگی با نمک ها
نسبت جذب 260 به 240 برای اسیدهای نوکلئیک خاص باید حدود 1/4 باشد، این نسبت برای تعیین مقدار نمک ها به کار می رود. وقتی نسبت جذب 260 به 240 کمتر از 1/4 باشد، اسیدهای نوکلئیک باید چند بار با اتانول 70 درصد و در نهایت با اتانول 95 درصد شستشو شوند.
برای دریافت خدمات مربوط به تعیین میزان غلظت و خلوص اسیدهای نوکلئیک
از طریق لینک خدمات آزمایشگاهی می توانید اقدام نمایید