✍ لام گیری گام سوم آزمایش کاریوتایپ

ویژگی یک لام خوب، داشتن تعداد کافی از سلول های متافازی است.

در مرحله لام گیری مربوط به تکنیک کاریوتیپ، سلول های نمونه باید روی لام پرتاپ شوند، به این دلیل که ضربه فیزیکی باعث متلاشی شدن غشاء و پخش شدن DNA روی لام می شود و بعد از رنگ آمیزی کروموزوم ها با کیفیت و فاصله بهتری قابل مشاهده اند. پس یک لام خوب باید تعداد کافی از سلول های متافازی را داشته باشد و خوب پراکنده شده و همچنین کروموزوم ها دارای حداقل همپوشانی و فاقد سیتوپلاسم قابل مشاهده باشند. سلول هایی که در مرحله هاروست تثبیت شدند، را روی لام های شیشه ای می ریزیم تا بعد از رنگ آمیزی بررسی کنیم. زمان برخورد سلول های شکننده و متورم به لام، تثبیت کننده در کل لام پخش و تبخیر می شود. همزمان با تبخیر تثبیت کننده، غشای سلولی کشیده و سلول مسطح می شود و سطح بیستری از لام را می پوشاند.

نکته مهم: در تهیه گستره های متافازی با کیفیت بالا، سرعت خشک شدن اهمیت بخصوصی دارد. عواملی که باعث تسریع فرآیند تبخیر می شوند مثل حرارت و خشکی، که پراکندگی را کم کرده، اما عواملی که سرعت تبخیر را کاهش می دهند مانند سرما و رطوبت، پراکندگی را تشدید می کنند.

 عواملی که در پراکندگی کروموزوم ها بر بروی لام موثر هستند

ارتفاع افتادن سلول ها روی لام، استفاده از لام گرم یا سرد یا به دمای اتاق رسیده، مدت زمان تیمار هیپوتونیک، دما و رطوبت محیط، حرارت دادن لام ها، استفاده از لام خشک یا مرطوب و زاویه لام  یا پیپت همگی در پراکندگی کروموزوم ها موثرند. میکروسکوپ فاز متضاد لام هایی که حاوی نمونه هستند را بررسی می کند. اگر سلول ها بیش از حد رقیق یا غلیظ باشند، می شود غلظت آن را روی لام تنظیم کرد و  هر متخصص موظف است که برای مواجه  کارآمد با این تغییرات تکنیک هایی داشته باشد. بعضی از آزمایشگاه ها برای خشک کردن لام ها از اتاقک مخصوص استفاده می کنند که جریان هوا، رطوبت و دما کنترل شود و متغیرهای مهم در تهیه لام استاندارد سازی شوند.

• در کشت(in situ) درون محیطی، سلول های تثبیت شده را روی لام نمی ریزند به این دلیل که آنها خودشان به لامل یا سطح جامد دیگری متصل هستند. در شرایط گسترش بهینه لامل خشک می شود و از لحاظ کیفیت متافاز و تعداد سلول ها بوسیله میکروسکوپ فاز متضاد بررسی می شود.

مراحل انجام آزمایش/ پروتکل _تهیه لام

۱-لام گیری هم مثل مراحل قبل شرایطی دارد، که از لحاظ دما و رطوبت دارای اهمیت زیادی است و دمای ۲۳-۲۰ درجه سانتی گراد و رطوبت۶۰-۵۰ درصد مناسب می باشد. در شرایط خشک، به عنوان مثال تابستان از بن ماری یا دستگاه بخور و یا لام خیس استفاده نمایید. بهتر است فضای ایزوله درست کنید. لام ها حتما̋ تمیز باشند و لام را پیش از اینکه استفاده کنید داخل متانول قرار دهید. سپس در آب مقطر دو بار تقطیر بگذارید و با گاز کاملا خشک کنید. لام ها را نیز می توان در محلول اسید سولفوکرومیک یک روز قبل قرار داده، سپس زیر آب روان یکی یکی آنها را شست. سپس در آب مقطر  یا آب روان در یخچال قرار داده و پس از سرد شدن استفاده  کرد.

۲-قبل از لام گیری، لوله را سانتریفوژ نموده، محلول رویی را بیرون بریزید وبه اندازه ۱-۵/۰سی سی فیکساتیو تازه به رسوب اضافه کنید. رنگ سوسپانسیون باید کمی شیری رنگ باشد.

۳-  با پیپت پاستور، یک یا دو قطره سوسپانسیون را از فاصله مناسب۲۰-۲۵ cm  روی لام بیاندازیم، و لام را تا زمانی که کامل خشک نشده حرکت ندهید.

۴- اسلاید را با نام بیمار، همانطور که خشک می شود لیبیل کنید.

۵- همیشه لام اول را برای هر بیمار  زیر میکروسکوپ چک کنید.

۶- ، اگر گستره کروموزومی که آماده کردید خوب نیست، فیکساتیو اضافه کنید و لام را به پایین بچرخانید و مجدد سعی کنید. اگر هنوز گستره خوب نیست، جدول troubleshooting chart را چک کنید.

۷-از هر لوله  ۶-۴ لام تهیه نمائید.

۸-مقدار ۲cc محلول فیکساتیو را به محلول باقیمانده اضافه نموده و برای استفاده بعدی در فریزر نگهداری نمائید.

بهتر است از لوله اپندرف و یا لوله شیشه ای کوچک که درآن محکم بسته می شود برای این منظور استفاده نمائید.

سلول های فیکس شده را تا زمانی که کارها و تکنیک های لازم برای بیمار انجام نشده دور نریزید. لام ها در oven60 درجه سانتیگراد به مدت یک شب قرار دهید و رنگ آمیزی را صبح روز بعد انجام داده و یا به مدت ۲-۱ هفته در درجه حرارت اتاق  نگهداری وسپس رنگ آمیزی نمائید. برای پیدا کردن و رفع اشکالات کار به جدول مشکلات پرتاپ کردن در تهیه لام و هاروست یا troubleshooting مراجعه کنید.

سیتوژنتیک – تکنیک کاریوتایپ- پروتکل/کشت نمونه خون محیطی

سیتوژ نتیک – تکنیک کاریوتایپ – پروتکل/هاروست (برداشت)

سیتوژنتیک – تکنیک کاریوتایپ پروتکل(مرحله لام گیری)

سیتوژنتیک – تکنیک کاریوتایپ – پروتکل/ رنگ آمیزی نواربندی (G-banding)