دستورالعمل رنگ آمیزی گرم باکتری در آزمایشگاه میکروبیولوژی
رنگ آمیزی گرم یکی از روش های مهم رنگ آمیزی باکتری ها و از تکنیک های پایه و پر کاربرد در آزمایشگاه میکروبی است، که به طور روتین جهت مطالعه نمونه های مستقیم بالینی یا اسمیر کشت به کار می رود. در واقع رنگ آمیزی گرم اولین گام در تشخیص و افتراق باکتری هاست که بر اساس آن استراتژی تشخیصی مناسب اتخاذ می شود. با این روش می توانیم بسیاری از باکتری ها، قارچ ها و تک یاخته ها را رنگ آمیزی کرد ولی برخی از ارگانیسم ها از جمله ترپونیا، میکوپلاسما، کلامیدیا و ریکتزیا به دلیل اندازه کوچک و یا نقص در دیواره سلولی با این روش قابل شناسایی نیستند.
این روش رنگ آمیزی باکتری ها در سال 1884 توسط باکتریولوژیست دانمارکی به نام هانس کریستین گرم ابداع شد. این روش بر اساس توانایی یا عدم توانایی میکروارگانیسم ها در نگه داشتن رنگ کریستال ویوله پس از رنگ بری با الکل-استن طراحی شده است.
در باکتری های گرم منفی ضخامت لایه پپتید و گلیکان بسیار کمتر از باکتری های گرم مثبت است ولی در عوض یک لایه ضخیم لیپو ساکاریدی(LPS) بر روی آن قرار گرفته است، در حالی که باکتری های گرم مثبت فاقد آن می باشند. اکثر باکتری ها گرم منفی هستند در حالی که تعدادی از باکتری ها و همچنین مخمر ها و کپک ها گرم مثبت هستند.
ویدیو آموزشی رنگ آمیزی باکتری ها به روش گرم با زیرنویس اختصاصی داروینو
رنگ آمیزی گرم همانند سایر روش های رنگ آمیزی باکتری ها موجب تضاد و کنتراست بین باکتری و محیط اطراف آنها می شود و فراتر از اون با این تکنیک، باکتری ها با توجه به ساختمان دیواره سلولی به دو گروه بزرگ گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می شوند.
در رنگ آمیزی گرم ابتدا رنگ کریستال ویوله به لایه پپتید و گلیکان نفوذ می کند، سپس محلول ید (لوگل) به عنوان تثبیت کننده رنگ اولیه عمل کرده و یک کمپلکس نامحلول با کریستال ویوله ایجاد می کند به طوری که در مرحله رنگ بری، باکتری های گرم مثبت که لایه پپتید و گلیکان ضخیمی دارند نسبت به از دست دادن رنگ مقاومت می کنند، در صورتی که در باکتری های گرم منفی بدلیل وجود لیپید در دیواره سلولی و حل شدن آن بوسیله مواد رنگ بر، کریستال ویوله را براحتی از دست می دهند.
در مرحله آخر رنگ آمیزی باکتری ها به روش گرم، فوشین یا سافرانین بعنوان رنگ مکمل یا متضاد افزوده می شود تا باکتری های بی رنگ (گرم منفی) را به رنگ قرمز رنگ آمیزی کند. در تصویر زیر خلاصه مراحل انجام رنگ آمیزی گرم را مشاهده می کنید.
ساختمان پپتید و گلیکان
پپتید و گلیکان پلیمر پیچیده ای است که از سه قسمت تشکیل شده است؛
- داربست متشکل از مولکول های N-استیل گلوکز آمین و N-استیل مورامیک اسید که به صورت یک در میان آرایش یافته اند. ساختمان داربست در تمام گونه های باکتری ها مشابه است.
- زنجیره تتراپپتیدی متشکل از 4 اسید آمینه L-آلانین، D-گلوتامیک، L-لیزین، و D-آلانین که به مولکول های N-استیل مورامیک اسید از داربست اصلی متصل هستند.در این زنجیره اسید آمینه سوم متغیر ترین اسید آمینه می باشد و در ساختمان پپتید و گلیکان باکتری های گرم منفی دی آمینو پیملیک(DPA) جایگزین L-لیزین(اسید آمینه سوم) گردیده است.
- پل های عرضی پپتیدی که اسید آمینه انتهایی (D-آلانین) یک زنجیره تتراپپتیدی را به اسید آمینه سوم(L-لیزین) زنجیره مجاور متصل می کند. ساختمان پل های عرضی در بین گونه های مختلف باکتری متنوع است. تمام زنجیره های پپتیدوگلیکان توسط پل های عرضی به هم متصل هستند و یک ماکرومولکول غول پیکر را تشکیل می دهند. بطوریکه باکتری های گرم مثبت تا 40 لایه پپتید وگلیکان و در باکتری های گرم منفی فقط یک یا دو لایه پپتید و گلیکان وجود دارد.
برای یادگیری روش های رنگ آمیزی باکتری ها و سایر تکنیک های مورد نیاز برای آزمایشگاه میکروبیولوژی
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید
برخی از خصوصیات باکتری های گرم مثبت و گرم منفی
1. باکتری های گرم مثبت نسبت به پنی سیلین و مواد ضد باکتریایی حساس تر از باکتری های گرم منفی می باشند
2. گرم مثبت بودن خاصیتی متغیر است ولی خاصیت گرم منفی تحت هیچ شرایطی از بین نمی رود، بنابراین در لام گرم مثبت ممکن است اجرام گرم منفی هم مشاهده شود ولی در لام گرم منفی هرگز باکتری گرم مثبت دیده نمی شود.
3. باکتری های گرم منفی نسبت به باکتری های گرم مثبت سخت رشد تر هستند و نیاز های غذایی پیچیده تری دارند.
4. باکتری های گرم منفی نسبت به اسید و قلیا حساس تر هستند.
5. باکتری های گرم مثبت تحت تاثیر موادی همچون لیزوزوم و پنی سیلین دیواره سلولی خود را از دست داده و به پروتوپلاست تبدیل می شوند. پروتوپلاست ها سلول های بسیار شکننده ای بوده و تنها در محیط های ایزوتونیک( هم فشار) قادر به ادامه حیات می باشند. پروتوپلاسیت قابلیت سنتز دیواره سلولی را به طور کامل از دست می دهد.
6. باکتری های گرم منفی با از دست دادن دیواره سلولی خود به اسفروپلاست تبدیل می شوند. اسفروپلاست قطعاتی از دیواره سلولی را در خود حفظ کرده و مجددا قادر به سنتز دیواره سلولی می باشد.
7. اگر سلول های فاقد دیواره قابلیت رشد و تکثیر را حفظ کنند تحت عنوان اشکال L باکتری ها خوانده می شوند، این فرم از باکتری ها نقش بسزایی در عود مجدد بیماری های عفونی دارند.
پروتکل/روش کار رنگ آمیزی گرم
- یک گسترش از باکتری گرم مثبت و یک گسترش از باکتری گرم منفی بر روی دو اسلاید جداگانه قرار داده می شوند
- اسلاید ها ابتدا باید در دمای آزمایشگاه خشک شوند
- اسلاید ها را 3 مرتبه از روی شعله عبور داده و به کمک حرارت تثبیت می کنیم
- گسترش ها را بوسیله رنگ کریستال ویوله به مدت 30 تا 60 ثانیه می پوشانیم
- اسلاید ها را با ملایمت با آب می شوییم
- بوسیله محلول ید (لوگل) به مدت 60 ثانیه گسترش را می پوشانیم
- اسلاید ها را با ملایمت با آب می شوییم
- با رنگ بر الکل-استن به مدت 15 تا 30 ثانیه عمل رنگ بری را انجام می دهیم. زمان رنگ بری بسته به ضخامت گسترش متغیر است ولی نباید زیاد انجام شود
- اسلاید ها را با ملایمت با آب می شوییم
- با معرف فوشین یا سافرانین به مدت 60 ثانیه گسترش را می پوشانیم
- اسلاید ها را با ملایمت با آب می شوییم
- اسلاید ها را خشک کرده و با عدسی 100X و روغن ایمرسیون آن ها را مشاهده می کنیم
بیشتر بخوانید :