✍ کاربرد تست آنتی بیوگرام و روشهای تست حساسیت دارویی باکتری ها

آنتی بیوتیکها مواد شیمیایی هستند که بصورت سنتتیک یا طبیعی از قارچ ها و باکتری ها استخراج می شوند. طیف فعالیت ضد میکروبی داروهای مختلف، متفاوت است. بعضی از آنها دامنه فعالیت بسیار محدودی داشته و تنها بر روی یک گروه از میکروارگانیسم ها موثر می باشند. برخی دیگر بطور وسیع الطیف بر روی بسیاری از میکروارگانیسم ها تاثیر دارند. بنابراین این سوال در ذهن ایجاد می شود که ما از کجا بدانیم کدام آنتی بیوتیک بر روی چه باکتری هایی موثر است؟ جواب سوال ما تست آنتی بیوگرام است که بصورت روتین در آزمایشگاه های تشخیصی انجام می گیرد. در واقع می توان اذعان داشت که در عفونت های میکروبی، آزمایشگاه دارو را تجویز می کند نه پزشک.

به منظور ارزیابی یک داروی مناسب باید در مورد نحوه تاثیر دارو، اثرات جانبی احتمالی آن در میزبان و طیف فعالیت ضد میکروبی دارو اطلاعات درستی داشت. مکانیسم اثر داروهای مختلف با یکدیگر متفاوت است. آنتی بیوتیکها تاثیر دوگانه ای بر باکتری ها دارند، بطوریکه در غلظت های پایین رشد باکتری را بصورت برگشت پذیر مهار می کنند و در غلظت های بالا موجب مرگ باکتری می شوند. بنابراین برای افتراق این دو اثر از دو اصطلاح MIC و MBC استفاده می شود.

اصطلاح MIC مخفف عبارت Minimum Inhibitory Concentration بوده و بیانگر حداقل غلظتی از یک آنتی بیوتیک است که می تواند رشد باکتری را متوقف نماید.

اصطلاح MBC  مخفف عبارت Minimum Bactericidal Concentration می باشد و به معنای حداقل غلظتی از دارو است که موجب مرگ باکتری می شود.

در انجام تست آنتی بیوگرام چهار سوال زیر باید مد نظر قرار بگیرد؛

1. کدام ارگانیسم باید تحت بررسی آنتی بیوگرام قرار گیرد؟
2. کدام روش آنتی بیوگرام مورد استفاده قرار می گیرد؟
3. کدام آنتی بیوتیک ها استفاده شوند؟
4. نتایج آزمایش چگونه گزارش شود؟

حساسیت دارویی اکثر باکتری های  بیماریزا شناخته شده است ولی بعضی اوقات لازم است تا به کمک آزمون تعیین حساسیت دارویی بهترین دارو از بین انواع  گوناگون دارو ها انتخاب شود. برای این منظور روش های مختلفی وجود دارد که عبارتند از:

• Disk diffusion (Kirby Bauer)
• Broth micro-dilution MIC (NCCLS)
• Etest

روش انتشار دیسک در آگار(Disk diffusion) یکی از روش های روتین و کاربردی در آزمایشگاه می باشد. در این روش دیسک های حاوی آنتی بیوتیک روی محیط کشت جامد قرار می گیرند. این دیسک ها هم اندازه بوده و با غلظت های مشخصی از آنتی بیوتیک آغشته شده اند. محیط کشت مورد استفاده در این تست مولر هینتون آگار نام دارد. آنتی بیوتیک از دیسک به محیط اطراف منتشر شده و مانع از رشد نمونه میکروبی مورد نظر می شود. با اندازه گیری قطر هاله عدم رشد به سادگی می توان حساسیت باکتری را نسبت به آنتی بیوتیک ها تعیین نمود.

اندازه قطر هاله عدم رشد به عوامل گوناگونی بستگی دارد که عبارتند از؛

• سرعت انتشار آنتی بیوتیک در محیط کشت
• غلظت آنتی بیوتیک
• تعداد باکتری تلقیح شده
• سرعت رشد باکتری
• میزان حساسیت باکتری نسبت به آنتی بیوتیک
• دوره انکوباسیون
• عمق آگار تهیه شده

روش دیگر تعیین حساسیت دارویی باکتری ها، آزمایش Etest می باشد. در این روش باکتری مورد آزمایش به روش خطی در سه جهت بر سطح آگار کشت داده می شود. نوار ها ی پلاستیکی مخصوص Etest بصورت شعاعی برسطح آگار قرار داده می شود. هر نوار بصورت گرادیان غلظت توسط یک آنتی بیوتک آغشته شده است. ابتدای نوار که از غلظت کمتری برخوردار است به سمت مرکز پلیت قرار دارد. پس از کاشت نوار ها، پلیت را به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کرده، سپس هاله بیضوی شکل عدم رشد نمایان می شود.

تست آنتی بیوگرام به روش Etest

پروتکل/روش انجام آزمایش آنتی بیوگرام

1. در شرایط استریل توسط سواپ پنبه ای مقداری از کشت میکروبی را در تمام سطح پلیت مغذی تلقیح کنید.
2. دیسک های آنتی بیوگرام را بوسیله پنس استریل در سطح پلیت قرار داده و با کمی فشار آنها را کاملا بر سطح آگار بچسبانید.
3. پلیت ها را بصورت وارونه در گرمخانه ۳۵ درجه به مدت ۲۴ ساعت نگهداری کنید.
4. پس از طی دوره انکوباسیون، بوسیله خط کش، قطر هاله عدم رشد را در اطراف دیسک ها اندازه گیری و ثبت کنید و با توجه به جدول همراه دیسک ها گزارش تست آنتی بیوگرام را برای هر یک از آنتی بیوتیک ها بصورت حساس(sensitive)، مقاوم(resistant) یا نیمه حساس(intermediate) گزارش کنید.

• توجه داشته باشید که این تست از حساسیت دقیقی برخوردار نیست، زیرا در تست های دقیق باید سوسپانسیون باکتری تهیه شده رقت مشخصی داشته باشد. برای تهیه رقت استاندارد از شاخص مک فارلند استفاده می شود و میزان کدورت سوسپانسیون باکتری را با کدورت ۰.۵ مک فارلند مقایسه می کنند. در این حالت سوسپانسیون استاندارد شده حاوی ۱.۵ ⨯۱۰۸ باکتری می باشد.
• برای تهیه کدورت ۰.۵ مک فارلند؛ ۰.۵ میلی لیتر کلرید باریم ۰.۴۸ مولار را در ۹۹.۵ میلی لیتر اسید سولفوریک۰.۳۶ نرمال مخلوط می کنند. این محیط به مدت ۶ ماه در تاریکی و در ظرف درب بسته قابل نگهداری است. اگر در هر زمان رسوبی در لوله مشاهده شود، محیط غیر قابل استفاده خواهد بود.

نکات مهم در حین آزمایش

1. برای تلقیح نمونه، ابتدا با سواپ استریل سوسپانسیون میکروبی را مخلوط کرده، سواپ را با قدرت به دیواره لوله تکیه داده و فشار دهید تا آب اضافی آن گرفته شود، سپس آن را به محیط کشت مولر هینتون انتقال داده و تمامی سطح محیط را به روش چمنی تلقیح کنیم.
2. دیسک های آنتی بیوگرام را نیم ساعت قبل از کاشت، بیرون از یخچال قرار دهید.
3. قبل از استفاده از محیط کشت آنها را از یخچال خارج می کنیم و به مدت ۱۰ تا ۲۰ دقیقه در انکوباتور ۳۵ درجه قرار دهید تا رطوبت موجود در سطح آگار خشک شود.
4. دیسک ها را بصورت دایره ای و به فاصله ۱.۲ سانتیمتر از یکدیگر بکارید.
5. ضخامت محیط کشت مولر هینتون آگار باید یکنواخت در تمامی پلیت ها ۵ میلیمتر باشد.
6. باید توجه داشت که دیسک های مورد استفاده متناسب با نوع باکتری انتخاب شود، برای مثال: هیچگاه برای باکتری گرم منفی دیسک پنی سیلین استفاده نکنید؛ زیرا نسبت به آن مقاوم است و یا برای کشت ادرار از دیسک کلرامفنیکل استفاده نکنید، برای اینکه این آنتی بیوتیک نمی تواند وارد مجاری ادراری شود.
7. هنگام خواندن نتیجه دقت کنید که همواره امتداد خط کش از وسط دیسک عبور کند.
8. همیشه قطر هاله عدم رشد را اندازه گیری کنید.
9. اگر در اطراف دیسک حتی یک کلنی هم باشد، باید از همانجا تا دیسک را اندازه گیری کرد نه قطر هاله را.
10. پس از تلقیح باکتری به محیط آنتی بیوگرام، در فاصله حداکثر ۱۵ دقیقه باید دیسک ها در سطح آگار کاشته شوند.
11. در برخی از باکتری های سخت رشد برای انجام تست آنتی بیوگرام از محیط های کشت اختصاصی استفاده می شود.
12. جهت تلقیح حتما از ایزوله خالص استفاده شود. اگر نمونه مورد استفاده خالص نباشد، تست کاملا اشتباه خواهد بود.
13. تا زمانی که دیسک را روی محیط فشار نداده اید، می توانید جای آن را تغییر دهید، اما بعد از فشار دادن دیسک و تثبیت آن به هیچ عنوان دیسک را جا به جا نکنید.
14. اگر نمونه تلقیح شده بعد از انکوباسیون بصورت یک دست رشد نکرده باشد، نشان دهنده این است که مقدار کلنی برداشت شده کمتر از استاندارد مک فارلند بوده است.
15. اگر در اطراف تمام دیسک ها هاله تشکیل شود و یا در اطراف هیچ یک از دیسک ها هاله ای تشکیل نشود باید تست تجدید شود.
16. اگر PH محیط  کشت مولر هینتون آگار مناسب نباشد نتایج اشتباه بدست می آید.
17. بسیاری از باکتری ها کم کم به آنتی بیوتیک های مختلف مقاوم می شوند، که این می تواند عمر آنتی بیوتیک ها را کم کند.
18. استفاده زیاد از سولفونامید ها باعث بیماری های عصب شنوایی و یا بیماری ها ی کلیوی خواهد شد.
19. مصرف زیاد پنی سیلین باعث ترومبوسیتوپنی و مصرف زیاد تتراسایکلین موجب گرانولوسیتوپنی می شود.
20. دیسک ها باید حداکثر به مدت یک ماه در یخچال و بیش از یک ماه در فریزر نگهداری شوند.
21. آمینوگلیکوزید ها بر روی باکتری های بی هوازی بی تاثیر هستند.
22. دیسک ایمیپنم بر روی باکتری های گرم مثبت و گرم منفی تاثیر دارد، ولی باید در عفونتهای شدید استفاده گردد تا مقاومت دارویی ایجاد نشود.
23. تتراسایکلین آنتی بیوتیک وسیع الطیفی است و معمولا بصورت موضعی استفاده می شود.