✍ کاربرد رنگ آمیزی و نواربندی کروموزوم ها در آزمایشگاه سیتوژنتیک

در این روش کروموزوم ها ابتدا با تریپسین تیمار می شوند تا محتوای پروتئینی آنها دناتور شود وسپس با رنگ متصل شونده به DNA _به نام گیمسا_رنگ آمیزی می شوند که هر کروموزوم الگوی مشخص و قابل تکراری از نوارهای تیره و روشن را نشان می دهند، هرچه نواحی غنی تراز AT باشد،  ناحیه تیره تر دیده می شود. نواحی تیره هترو کروماتین هستند. نوار بندی G، آنالیز کروموزومی با کیفیت بالا را همراه با ۴۰۰ تا ۵۰۰ نوار درهر مجموعه هاپلوئیدی فراهم می کند. هرکدام از این نوارها به طور متوسط معادل ۶۰۰۰  تا ۸۰۰۰ kb از DNA می باشند.نوار بندی با تفکیک بالای کروموزم ها در مراحل اولیه میتوز مثل پروفاز یا پرومتافاز حساسیت بیشتری تا ۸۰۰ باند در هر مجموعه هاپلوئیدی فراهم می کند، دراین روش ابتدا تقسیم سلولی بامعرفی مثل متوتروکسات یا تیمیدین مهار می شود. سپس اضافه کردن اسیدفولیک یا دئوکسی سیتیدین به محیط کشت، سلول ها را وارد تقسیم میتوز می سازد. در ادامه کلشی سین در زمانی خاص که تعدادبیشتری از سلول ها درمرحله پرومتافا ز می باشند و کروموزوم ها به طور کامل متراکم نشدند، اضافه می شود.بنابراین یک الگوی نواربندی دقیق تری به دست می آید.

پروتکل/دستورالعمل تریپسین

روش کار:

۱-پس از لام گیری، لام ها را به مدت یک شب در oven 60درجه سانتی گراد و یا به مدت ۲-۱ هفته  در درجه حرارت اتاق نگهداری کنید.

۲-در این مرحله لام را داخل تریپسین  با غلظت۵۰mg  در PBS 100ml در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۸۰-۳۰ ثانیه قرار دهید.

۳- در داخل PBS کاملا سرد شستشو دهید و از PBS سرد بعدی نیز رد کنید.

۴-سپس از یک بافر رنگ بگذرانید و بعد در محلول رنگ گیمسای ۱۰% به مدت ۵ دقیقه قرار دهید.

۵-در این مرحله لام ها را با آب بشوئید و خشک کنید. همان روز با استفاده از چسپ انتالان لامل گذاری کنید.

توجه: اگر مدت زمان یا غلظت تریپسین کم باشد، تعداد باندهای کروموزوم کم و رنگشان تیره تر است و در صورتی که غلظت تریپسین زیاد و یا مدت زمان زیاد باشد، کروموزوم ها خرد شده و کمرنگ هستند. بنابراین بهتر است بعد از ۴-۳ ساعت، یا پس از استفاده برای ۸-۶ بیمار، تریپسین را عوض نموده، و از تریپسین و محلول شستشوی (جدید)تازه استفاده نمائید. در صورت شارپ بودن باندها، احتمال گرم نبودن محلول (تا ۳۷ درجه) و مناسب نبودن PH وجود دارد.

پروتکل/دستورالعمل لیشمن (Leishman s stain)

روش کار:

۱-برای شروع ابتدا حداقل به مدت دو روز لام ها کهنه باشند. لام ها را به مدت ۱۰-۵ ثانیه در محلول تریپسین قرار دهید.

۲-لام ها را در یک محلول سالین شستشو دهید  (Rinse).

۳-سپس در بافر فسفات فرو ببرید و بشوئید

۴-لام ها روی یک رک (جای لام یا غیره) را قرار داده و در روی ظرفشویی قرار دهید. و سپس با رنگ لیشمن به مدت ۵ دقیقه رنگ کنید.

۵-مجددا اسلاید ها را در بافر فسفات بشوئید.

۶-بعد در آب مقطر بشوئید.

۷-در یک اتو یا گرمخانه ۴۰ درجه سانتیگراد آن ها را خشک کنید.

پروتکل/دستورالعمل پانکراتین (pancreatin)

آماده کردن محلول ها:

۱- ابتدا محلول NaCL تهیه کنید. ۵/۸ گرم NaCL  را با آب مقطر به حجم یک لیتر برسانید.

۲- در این مرحله ۵/۲ گرم پودر پانکراتین را در حین تکان دادن به ۱۰۰cc محلول NaCL  اضافه کنید تا ژله ای نشود (محلول _A استوک)

۳-در این مرحله  ۲.۵ccمحلول A پانکراتین را با ۴۷.۵ cc محلول هنکس مخلوط  و در ۳۷ درجه سانتی گراد قرار دهید (محلول کار).

۴-بعد ۲.۵cc سرم  را با ۴۷.۵ cc  نرمال سالین مخلوط کنید و در ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵-۱۰ دقیقه بماند (محلول شستشوی شماره ۱).

۵-در این مرحله ۵۰ cc نرمال سالین (۱/۹ گرم NaCL را با آب مقطر به حجم یک لیتر برسانید) در دمای اتاق به مدت ۱۵-۱۰ دقیقه بماند ( محلول شستشوی شماره ۲).

۶-محلول رنگ را بر مبنای پروتکل تریپسین تهیه کنید.

روش انجام کار/دستورالعمل:

۱-ابتدا لام ها را بعد از لام گیری به مدت یک شب در ۶۰ oven  درجه سانتی گراد و یا به مدت ۲-۱ هفته در درجه حرارت اتاق نگهداری کنید.

۲-بعد لام را داخل پانکراتین با غلظت ۱۵۰ میلی گرم در ۱۰۰میلی لیتر  Hanks به مدت ۸۰-۳۰ ثانیه  قرار دهید.

۳-در محلول شستشوی شماره۱، یک دقیقه شستشو دهید. سپس در محلول شستشوی شماره ۲، نیز یک دقیقه شستشو دهید.

۴-به مدت ۵ دقیقه در محلول رنگ قرار دهید.

کاربرد این نوع رنگ آمیزی

کاربرد این نوع رنگ آمیزی این است که، تریپسین برای دناتوره شدن هیستون ها، رنگ آمیزی گیمسا و ظهور نوارهای تیره و روشن، آنالیز روتین کروموزومی است، تشخیص اختلالات ساختاری کروموزوم ها (حذف ها، وارونگی ها،حلقه ها، جا به جایی ها (ترنس لوکیشن ها)، آنیوپلوئیدی ها، مونوزومی ها، تریزومی ها  و نقاط شکننده) و همینطور کروماتین بازوی بلند کروموزوم های Y, 16, 9 ,1

تذکر: پروتکل بر اساس setup هر آزمایشگاه متفاوت است.

سیتوژنتیک – تکنیک کاریوتایپ- پروتکل/کشت نمونه خون محیطی

سیتوژ نتیک – تکنیک کاریوتایپ – پروتکل/هاروست (برداشت)

سیتوژنتیک – تکنیک کاریوتایپ پروتکل(مرحله لام گیری)

سیتوژنتیک – تکنیک کاریوتایپ – پروتکل/ رنگ آمیزی نواربندی (G-banding)