رنگ آمیزی کروموزوم ها یا نواربندی آخرین مرحله آزمایش کاریوتایپ
برای مطالعه کروموزوم های انسان، سلول های مورد استفاده باید زنده، هسته دار و قادر به تقسیم باشند که معمول ترین آنها لنفوسیت های خون محیطی است، اگرچه نمونه مناسب آنالیز کروموزومی را می توان نسبتا به سهولت از پوست، مغز استخوان، عضله و پرزهای کوریونی یا سلول های مایع آمنیوتیک و دیگر سلول های بدن به دست آورد، ولی خون محیطی و مایع آمنیوتیک بیشتر از بقیه موارد مورد استفاده هستند.
خون محیطی را به محیط کشت حاوی فیتوهماگلوتینین اضافه می کنند که لنفوسیت های T را تحریک به تقسیم می نماید. سلول ها در دمای ۳۷درجه و به مدت ۳ روز کشت داده می شوند تا سلول ها تقسیم شده و سپس کلشی سین به محیط اضافه می کنند. در ادامه نمک هیپوتونیک اضافه می شود که باعث لیز سلول ها شده و کروموزوم ها پخش شده. سپس کروموزوم ها را روی اسلاید تثبیت (فیکس) نموده و جهت آنالیز رنگ آمیزی می کنند.
- کلشی سین، ویژگی بسیار سودمندی در جلوگیری از تشکیل دوک دارد، به طوریکه تقسیم سلولی را در متافاز متوقف می کند.
شناسایی و گروه بندی کروموزوم ها با رنگ آمیزی ساده دشوار است. از تکنیک باندینگ که در آن باند ها(نوارها) در کروموزوم ها ظاهر می شوند استفاده می شود. تکنیک های باندینگ از نظر کاربرد، نوع رنگ و منطقه ای که رنگ آمیزی می شود با هم متفاوت هستند.
انواع روش های نواربندی کروموزوم ها
در ابتدای این مقاله آموزشی جامع، به شرح مختصر و پروتکل یا دستورالعمل G-banding که مهم ترین و کاربردی ترین روش نواربندی کروموزوم ها است می پردازیم و در ادامه آن به سراغ سایر روش های رنگ آمیزی کروموزوم ها که استفاده کاربردی کمتری در آزمایشگاه سیتوژنتیک دارند خواهیم پرداخت.
G-باندینگ (G-banding):
از رنگ گیمسا برای رنگ آمیزی مناطق غنی از آدنین و تیمین (AT) و برای کاریوتایپ خون استفاده می شود.
رنگ آمیزی کروموزوم ها به روش G-باندینگ مهم ترین و مناسب ترین روش برای کاریوتایپینگ خون است.
در این روش رنگ آمیزی کروموزوم ها، ابتدا آن ها با تریپسین تیمار می شوند تا محتوای پروتئینی آنها دناتور شود وسپس با رنگ متصل شونده به DNA به نام گیمسا رنگ آمیزی می شوند که هر کروموزوم الگوی مشخص و قابل تکراری از نوارهای تیره و روشن را نشان می دهند، هرچه نواحی غنی تراز AT باشد، ناحیه تیره تر دیده می شود. نواحی تیره هترو کروماتین هستند.
نوار بندی G، آنالیز کروموزومی با کیفیت بالا را همراه با ۴۰۰ تا ۵۰۰ نوار در هر مجموعه هاپلوئیدی فراهم می کند. هرکدام از این نوارها به طور متوسط معادل ۶۰۰۰ تا ۸۰۰۰ kb از DNA می باشند. نوار بندی با تفکیک بالای کروموزم ها در مراحل اولیه میتوز مثل پروفاز یا پرومتافاز حساسیت بیشتری تا ۸۰۰ باند در هر مجموعه هاپلوئیدی فراهم می کند، دراین روش ابتدا تقسیم سلولی بامعرفی مثل متوتروکسات یا تیمیدین مهار می شود.
سپس اضافه کردن اسیدفولیک یا دئوکسی سیتیدین به محیط کشت، سلول ها را وارد تقسیم میتوز می سازد. در ادامه کلشی سین در زمانی خاص که تعدادبیشتری از سلول ها درمرحله پرومتافا ز می باشند و کروموزوم ها به طور کامل متراکم نشدند، اضافه می شود بنابراین یک الگوی نواربندی دقیق تری به دست می آید.
پروتکل/دستورالعمل تریپسین
روش کار:
1-پس از لام گیری، لام ها را به مدت یک شب در آون 60درجه سانتی گراد و یا به مدت ۲-۱ هفته در درجه حرارت اتاق نگهداری کنید.
2-در این مرحله لام را داخل تریپسین با غلظت 50mg در PBS 100ml در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۸۰-۳۰ ثانیه قرار دهید.
3- در داخل PBS کاملا سرد شستشو دهید و از PBS سرد بعدی نیز رد کنید.
4-سپس از یک بافر رنگ بگذرانید و بعد در محلول رنگ گیمسای ۱۰% به مدت ۵ دقیقه قرار دهید.
5-در این مرحله لام ها را با آب بشوئید و خشک کنید. همان روز با استفاده از چسپ انتالان لامل گذاری کنید.
نکته مهم: اگر مدت زمان یا غلظت تریپسین کم باشد، تعداد باندهای کروموزوم کم و رنگشان تیره تر است و در صورتی که غلظت تریپسین زیاد و یا مدت زمان زیاد باشد، کروموزوم ها خرد شده و کمرنگ هستند. بنابراین بهتر است بعد از ۴-۳ ساعت، یا پس از استفاده برای ۸-۶ بیمار، تریپسین را عوض نموده، و از تریپسین و محلول شستشوی (جدید)تازه استفاده نمائید. در صورت شارپ بودن باندها، احتمال گرم نبودن محلول (تا ۳۷ درجه) و مناسب نبودن PH وجود دارد.
پروتکل/دستورالعمل لیشمن (Leishman s stain)
روش کار:
1-برای شروع ابتدا حداقل به مدت دو روز لام ها کهنه باشند. لام ها را به مدت ۱۰-۵ ثانیه در محلول تریپسین قرار دهید.
2-لام ها را در یک محلول سالین شستشو دهید (Rinse).
3-سپس در بافر فسفات فرو ببرید و بشوئید
4-لام ها روی یک رک (جای لام یا غیره) را قرار داده و در روی ظرفشویی قرار دهید. و سپس با رنگ لیشمن به مدت ۵ دقیقه رنگ کنید.
5-مجددا اسلاید ها را در بافر فسفات بشوئید.
6-بعد در آب مقطر بشوئید.
7-در یک اتو یا گرمخانه ۴۰ درجه سانتیگراد آن ها را خشک کنید.
پروتکل/دستورالعمل پانکراتین (pancreatin)
آماده کردن محلول ها:
1- ابتدا محلول NaCL تهیه کنید. ۵/۸ گرم NaCL را با آب مقطر به حجم یک لیتر برسانید.
2- در این مرحله ۵/۲ گرم پودر پانکراتین را در حین تکان دادن به 100cc محلول NaCL اضافه کنید تا ژله ای نشود (محلول _A استوک)
3-در این مرحله 2.5ccمحلول A پانکراتین را با 47.5 cc محلول هنکس مخلوط و در ۳۷ درجه سانتی گراد قرار دهید (محلول کار).
4-بعد 2.5cc سرم را با 47.5 cc نرمال سالین مخلوط کنید و در ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵-۱۰ دقیقه بماند (محلول شستشوی شماره ۱).
5-در این مرحله 50 cc نرمال سالین (۱/۹ گرم NaCL را با آب مقطر به حجم یک لیتر برسانید) در دمای اتاق به مدت 15-10 دقیقه بماند ( محلول شستشوی شماره ۲).
6-محلول رنگ را بر مبنای پروتکل تریپسین تهیه کنید.
روش کار:
1-ابتدا لام ها را بعد از لام گیری به مدت یک شب در 60 oven درجه سانتی گراد و یا به مدت ۲-۱ هفته در درجه حرارت اتاق نگهداری کنید.
2-بعد لام را داخل پانکراتین با غلظت ۱۵۰ میلی گرم در ۱۰۰میلی لیتر Hanks به مدت ۸۰-۳۰ ثانیه قرار دهید.
3-در محلول شستشوی شماره۱، یک دقیقه شستشو دهید. سپس در محلول شستشوی شماره ۲، نیز یک دقیقه شستشو دهید.
4-به مدت ۵ دقیقه در محلول رنگ قرار دهید.
تریپسین برای دناتوره شدن هیستون ها، رنگ آمیزی گیمسا و ظهور نوارهای تیره و روشن، آنالیز روتین کروموزومی است، تشخیص اختلالات ساختاری کروموزوم ها (حذف ها، وارونگی ها،حلقه ها، جا به جایی ها (ترنس لوکیشن ها)، آناپلوئیدی ها، مونوزومی ها، تریزومی ها و نقاط شکننده) و همینطور کروماتین بازوی بلند کروموزوم های Y, 16, 9 ,1
تذکر: پروتکل بر اساس setup هر آزمایشگاه متفاوت است.
برای یادگیری و شرکت در دوره های کارآموزی سیتوژنتیک و کاریوتایپ خون
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.
C-باندینگ (C-banding):
در این نوع رنگ آمیزی از رنگ گیمسا و باریم هیدروکسید برای رنگ آمیزی سانترومر و بازوی بلند(q) کروموزوم Y استفاده می شود.
این تکنیک اختصاصا نواحی هتروکروماتین اجباری اطراف سانترومر، نواحی پلی مورفیسم توارثی موجود در کرموزوم _های ۱،۹،۱۶ و انتهای بازوی بلند کروموزوم Y را رنگ آمیزی می نماید. نواحی مثبت باند C حاوی توالی DNA آلفا ساتالیت (ماهواره)شدیدا تکراری است که در مرحله همانندسازی دیرتر از سایر نقاط همانندسازی می شوند.
با نواربندی CBG نوارهای C به وسیله هیدروکسید باریم و بااستفاده از گیمسا،DNAبه طور انتخابی با هیدروکسید باریم دپورینه شده و دورشته ازهم باز می شوند، سپس باگرمخانه گذاری در محلول نمکی گرم قطعات حاصل شسته می شوند. هترو کروماتین اجباری در برابر تجزیه مقاوم باقی مانده و بنابراین تنها بخشی است که به رنگ گیمسا متصل می شود.
درنتیجه کروموزوم ها به صورت محو وشبح مانند دیده می شوند که اطراف سانترومر در نواحی پلی مورفیک پری سانترومری کروموزوم های ۱،۹،۱۶ ودر انتهای بازوی بلند Y به شدت رنگ گرفته و تیره هستند نواربندی C برای تعیین کروموزم های دی سانتریک، دی سانتریک کاذب و نیز مطالعه کروموزوم های مارکر و انواع پلی مورفیک مفید است. این تکنیک برای بررسی پلی مورفیسم ها سودمند می باشد.
اندازه band_Cها ممکن است از فردی به فرد دیگر تغییر کند و متفاوت باشد و این ممکن است با مقادیر متفاوت DNA ساتالیت مطابقت داشته باشد
R-باندینگ (R-banding): (نواربندی معکوس)
حرارت دهی با بافر فسفات(PBS) و رنگ آمیزی با گیمسا برای شناسایی نقاط غنی از ژن است.
در این تکنیک الگوی نواربندی مخالف نوار بندی های G و Q است ، به این ترتیب که نواحی که در G به صورت تیره و هتروکروماتینی دیده می شود، در R به صورت روشن و یوکروماتینی است. این تکنیک به دو روش فلورسنت و غیر فلورسنت انجام می شود. از محلول نمک داغ برای دناتوره کردن DNA و برای هضم پروتئین از گرما استفاده می شود و رنگ آمیزی با رنگ گیمسا انجام می شود. تکنیکR_banding بسیار سودمند است برای مطالعه ساختارهای انتهایی کروموزوم ها، زیرا این ساختارها در G_banding به صورت روشن دیده می شود.
تکنیک banding_R بسیار سودمند است برای مطالعه ساختارهای انتهایی کروموزوم ها، زیرا این ساختارها در banding_G به صورت روشن دیده می شود
T-باندینگ (T-banding):
نواربندی T نوعی نواربندی R است که دران فقط نواحی انتهایی کروموزوم ها یا تلومرها رنگ می گیرند. تیمار شدیدتر کروموزوم ها، رنگ پذیری را به جز در نواحی تلومر که مقاوم به حرارت هستند کاهش می دهد. تکنیک های نواربندی T به صورت فلورسنت وغیرفلورسنت هستند.
Q-باندینگ (Q-banding): نواربندی کوئیناکرین
استفاده از رنگ کیناکرین دی هیدروکلراید برای رنگ آمیزی مناطق غنی از AT و با هدف شناسایی و بررسی سانترومر کروموزوم های شماره ۳، ۴، ۱۳، کروموزوم آکروسانتریک و کروموزوم Y استفاده می شود.
اولین نوار بندی کروموزوم های انسان روش نوار بندی Q بود که یک تکنیک فلورسنت است. در این روش تعدادی از فلوروکروم ها مثل کوئیناکربن دی هیدروکلراید به DNA اتصال پیدا می کند و در صورت تحریک با طول موج مناسب، الگوی نواربندی تیره و روشن بوجود می آورند.
در تکنیک نواربندیQ ، نواحی تیره و روشن ایجاد می شود که قابل تشخیص و متمایز هستند و نواحی روشن غنی از A_T هستند. نکته مهمی که باید به آن توجه کنید این است که در نواربندی به روش Q، شبیه نوار بندی G است بجز چند مورد. ناحیه انتهایی بازوی بلند کروموزوم Y و نواحی پلی مورفیک (چندشکلی) پری سانترومری که در روی کروموزوم ۱ و ۱۶ قرار دارند، رنگ فلورسنت را گرفته و روشن دیده می شوند.
در نواحی پلی مورفیک باند Q در سانترومر کروموزوم های ۳و۴ وجود دارد و با نوار بندی G مشخص نمی شود، پس نتیجه گیری می شود که تکنیک نواربندی Q تایید حضور کروموزوم Y و یا نواحی پلی مورفیک که در بالا توضیح دادم مناسب است.
اکثر رنگ های فلورسنت پایدار نیستند و باید برای حل این مشکل از اتاق تاریک و میکروسکوپ های فلورسانس گران قیمت استفاده کنند، به این دلیل نواربندی Q در بیشتر آزمایشگاه ها به شکل متعارف انجام نمی شود و به جای آن تکنیک FISH بکار می برند.
در باندینگ G و Q نواحی غنی از بازهای آلی گوانین (G) و (C) فشردهتر هستند و رنگ کمتری را به خود جذب میکنند بنابراین به صورت روشن تر دیده میشوند و نواحی غنی از A و T که هتروکروماتینی هستند رنگ بیشتری به خود جذب میکنند و تیرهتر دیده میشوند. رنگ آمیزی R برعکس الگوی باندهای G و Q است. یعنی نواحی فشرده کروموزومها تیره رنگ و نواحی دیگر روشن دیده میشوند.
نواربندی cd (نقطه سانترومری یا رنگ آمیزی کینه توکور)
دراین تکنیک یک جفت نقطه در هر سانترومر روی هر کروماتید ایجاد می شود. این نقاط مختص نواحی سانترومری هستند و مشابه نوارهای C نمی باشند. برخلاف نواربندی C که نواحی سانترومری فعال و غیرفعال در آن رنگ می شدند، تنها سانترومرهای عملکردی یا فعال با رنگ آمیزی cdرنگ می گیرند. رنگ آمیزی cd برای تمایز سانترومرهای عملکردی از غیر عملکردی و نیز مطالعه جابه جایی های رابرت سونی جابه جایی سانترومرها در کروموزوم های آکروسانتریک، کروموزوم های حلقوی وکروموزوم های مارکر استفاده می شود .
نوار بندی11–G (گیمسا در PH یازده)
این تکنیک به طور اختصاصی نواحی پری سانترومریک تمام کروموزوم ها، نواحی هتروکروماتینی کروموزوم های ۱،۹،۱۶ و انتهای Yq و ساتالیت های کروموزوم های اکروسانتریک را رنگ آمیزی می کند. با تیمار قلیایی،نواحی اتصال گیمسا از بین می رود. بهترین نتیجه در 11/PH6 بدست می آید. در این PH شدیدا قلیایی، تنها ترکیب azure از گیمسا به اکثریت کروموزوم ها متصل شده و آنها را به رنگ آبی روشن در می آورد. ترکیب eosin درگیمسا به نواحی هترومورفیک ذکر شده متصل می شود و آنها را به رنگ ارغوانی در می آورد.
نوار بندی 11_G برای تشخیص این پلی مورفیسم های هتروکروماتینی به کار می رود. نواربندی11_G کاربرد تحقیقاتی نیز دارد و در سلول های هیبرید برای تمایز کروموزوم های انسانی و جونده از هم به کار می رود. کروموزوم های انسانی آبی رنگ می شوند در حالی که کدوموزوم هوی موشی با رنگ ارغوانی حفظ می شوند.
نواربندی NOR_banding (رنگ آمیزی نقره برای نواحی سازمان دهنده هستکی)
این تکنیک به طور انتخابی نواحی سازمان دهنده هستکی (NORs) در ساقه ماهواره ای کروموزوم های آکروسانتریک را رنگ آمیزی می نماید. این نواحی حاوی ژن های RNA ریبوزومی هستند و با نیترات نقره رنگ می گیرند. به لحاظ تئوری 10 NOR در هر سلول (یک مورد به ازای هر کروموزوم آکروسانتریک) وجود دارد.
با این وجود همیشه تمام آنها رنگ نمی گیرند چرا که نیترات نقره تنها ژن های rRNA فعال را رنگ می کند. نواحی NOR دارای کپی های زیادی از ترادفهای rDNA یا ژن های مربوط به بخش بزرگتر 285) RNA ریبوزومی) همچنین(S18) می باشند. الگوی NOR-Ag کروموزوم های آکروسانتریک در یک فرد دارای ویژگی های قابل توارث ثابت بوده و در مجموع با الگوهای R بندها در شناسایی منشا والدینی و همچنین برای disjunction- Non میتوزی در تریزومی های کروموزوم های آکروسانتریک انسانی کاربرد دارند.
کاربردهای تکنیک NOR_banding
- برای شناسایی کروموزوم های مارکر
- مطالعه پلی مورفیسم کروموزوم های آکروسانتریک
رنگ آمیزی DAPI/DA (۴ و۶ دی آمینو ۲- فنول۱ ایندول/ دیستامایسین A)
در این رنگ آمیزی، از یک رنگ فلورسنت به نام DAPI و یک آنتی بیوتیک غیر فلورسنت تحت عنوان دیستامایسین A باهم استفاده می شوند، هر دو در نواحی دو رشته DNA غنی از A_T باندهای پایدار و مشابه غیر یکسان ایجاد می کنند. وقتی به طور همزمان این دو ( DAPI/DA) استفاده می شود، بعضی از نواحی هتروکروماتین اجباری غنی از بازهای A_T در نواحی باند C کروموزوم های ۱۶،۹،۱ و همچنین انتهای Yq و همینطور بازوی کوتاه کروموزوم ۱۵ فلورسانس می شوند.
برای تمایز نواحی ساتلایت در کروموزوم های اکروسانتریک پیش از اینکه روش FISH ابداع شود، تنها تکنیک مورد استفاده همین رنگ آمیزی DAPI/DA بود.
- کاربرد روش رنگ آمیزی DAPI/DA
بازآرایی کروموزوم ۱۵ را شناسایی می کند، تنوع در نواحی پلی مورفیک کروموزوم های ۱، ۹، ۱۶ را تایید می کند، و از این روش رنگ آمیزی برای مطالعه کروموزوم های مارکر با ماهواره ها مورد استفاده قرار می گیرد.
برای کار در آزمایشگاه سیتوژنتیک در 2 رده شغلی با عناوین بخش فنی و بخش آنالیز کروموزومی کارمند جذب می شود که معمولا افراد مسلط به یکی از بخش های نام برده می توانند وارد بازار کار آن شوند.
چگونه می توانیم رزومه علمی خود را ارتقا دهیم؟
بیشتر بخوانید: