✍ پروتکل/دستورالعمل مراحل انجام انواع کشت سلولی مایع آمنیوتیک 

پروتکل۱: راه اندازی کشت مایع آمنیوتیک

 

a. کشت coverslip

۱- پتری دیش پلاستیکی

۲-  پیپت پاستور پلاستیکی

۳-  پنس جراحی نازک (fine forceps)

۴-  انکوباتور سه گازه دار یا CO2 دار در ۳۷ درجه سانتی گراد

۵- باکس پلاستیکی

۶- coverslips

نحوه انجام کشت های coverslip:

۱-  برای انجام کار ابتدا اگر نیاز است، مایع آمنیوتیک را به دو لوله سانتریفوژ مخروطی شکل منتقل کنید، که بر روی لوله ها که مایع آمنیوتیک ریختیم نام بیمار و شماره آزمایشگاه لیبل و با شماره ۱ و۲ مشخص شود. در صورتی که به آزمایش AFP نیاز است،  O.5 ml برای این تست نگه دارید.

۲- لوله ها را در RPM (1200-1300)  ۲۰۰g به مدت ۵ دقیقه سانتریفوژ کنید.

۳- سایز پلیت (رسوب) را در هر دو لوله تخمین بزنید و محلول رویی را به یک ظرف نمونه اصلی بریزید. این محلول را برای آنالیز تست های بیوشیمیایی که نیاز است فریز کنید.

۴- پلیت را با تکان دادن آرام، دوباره به حالت محلول در بیارید و.۰۵ml  محیط مناسب برای هر کشت اضافه کنید.

در این مرحله: اگر هیچ پلیتی مشاهده نشد – یک ظرف کشت از هر لوله سانتریفوژ بگذارید، پلیت قابل دیدن – دو ظرف کشت هر لوله سانتریفوژ بگذارید و پلیت های بزرگ – دو یا سه ظرف کشت از هر لوله سانتریفوژ بگذارید. در صورت امکان، از محیط های مختلف برای لوله های ۱ و ۲ استفاده شود.

۵- تعداد مشخص از پتری دیش ها را لیبل کنید و forceps استریل به کار ببرید، و یک لامل شیشه ای داخل هر دیش قرار دهید.

۶- با استفاده از یک پیپت پاستور پلاستیکی  .۰۵ml سوسپانسیون سلولی را بر روی هر لامل شیشه ای قرار دهید و مراقب باشید که کل سوسپانسیون را به یک coverslip انحصار ندهید. ولیکن، به منظور اطمینان از رشد back-up  یک قطره کوچک از سوسپانسیون را روی پتری دیش قرار دهید.

۷- کشت ها را در ۳۷ درجه سانتی گراد در یک انکوباتور CO2 یا ترایپل gass انکوبه کنید. ایده ال است که، یک  coverslip از هر لوله سانتریفوژ، در دو انکوبه جداگانه، با منابع گاز جداگانه انکوبه شود.

 

 

b. کشت با فلاسک یا در لوله

۱- لوله های یک طرف تخت یا فلاسک های ۲۵ سانتی متر مربع لوله لیتون

۲- انکوباتور ۳۷ درجه (گاز برای کشت های باز، بدون گاز برای کشت های بسته)

۳- سیلندر گاز  ۵% CO2 در هوا

 

 

نحوه انجام کشت های با لوله یا فلاسک

۱- مراحل  ۳-۱ را مثل بالا انجام دهید. اگر لوله هایی که یک طرفشون تخت است استفاده می کنید (لوله لیتون)، نمونه را مستقیما در هر دو لوله تقسیم کرده و مراحل ۳-۱ را  ادامه دهید.

۲- پلیت را به آرامی با تکان دادن به حالت معلق (محلول) در بیاورید. به هر لوله کشت، یک میلی لیتر محیط کامل یا مقدار مشخص محیط به هر لوله سانتریفوژ و اگر با فلاسک شروع کردید (۳ml به هر لوله) اضافه کنید. سوسپانسیون سلولی را، اگر فلاسک استفاده می شود، به فلاسک منتقل کنید. اگر امکان دارد دو محیط مختلف به کار ببرید.

۳- برای سیستم بسته، محیط با HEPES_buffered به کار ببرید. در لوله ها را ببندید و در ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه کنید. برای سیستم بسته محیط با بافر بیکربنات به کار ببرید،  ۵%  CO2 در هوای محیط کشت، در لوله ها را بسته و در ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه کنید. برای سیستم باز، درب لوله ها را به طور کامل بپیچانید و سپس شل کنید با یک پیچ، و در یک انکوباتور  گاز دار در ۳۷ درجه سانتی گراد قرار بدهید.

نکته: اگر اختصاصا نمونه کم باشد، نمونه می تواند اول spun down شود و سپس این تست ها بر روی محلول رویی، (supernatant) انجام شود. روش دیگه اینکه از باکس های پلاستیکی که با %۵  CO2  درهوا seal شده  استفاده کنید.

 

بررسی پایداری کشت

– کشت های coverslip

دو روز پس از set up کشت،  ۱.۵ml محیط کشت کامل مخصوص به هر لوله کشت از لبه دیش اضافه کنید، به طوری که کمترین آشفتگی را در سوسپانسیون سلولی original و سلول های تازه چسبیده شده بوجود بیارید، و دوباره به مدت ۴۸h انکوبه کنید. پس از این زمان، کشت ها را زیر میکروسکوپ invert ببینید، اگر رشد کافی وجود داشته باشد، سوسپانسیون سلولی را برای شروع یک کشت back-up جداگانه به کار ببرید، و محیط تازه به کشت original اضافه کنید. متناوبا اگر رشد کافی وجود داشته باشد، همین روش روز پنجم انجام شود. بعد ازآن کشت ها مرتب امتحان بشوند و محیط کشت روزانه عوض شود. تا زمانی که آن ها برای هاروست آماده شوند ( محیط کشت می تواند یا از طریق یک پمپ به داخل یک ضدعفونی کننده کشیده شده و یا با دقت به داخل یک ظرف شامل ماده ضدعفونی کننده خالی شود). عمده کشت ها بین ۸-۵ روز هاروست می شوند، اگر چه همیشه چند case با میزان رشد آهسته تر داریم. در صورتی که  پس از ۱۰-۷ روز هیچ علامتی ار چسبندگی سلول یا رشد سلول وجود نداشته باشد، کارشناس آزمایشگاه، می تواند نمونه آمنیوسنتز را تکرار کند. چک کنید و کشت های back – up  را در حالت رشد آهسته یا حالتی که ذاتا کشت منفی می شود نگه دارید.

 کشت های در لوله و فلاسک

کشت ها را به مدت ۷-۶ روز بدون اینکه بهشون سربزنید  رها کنید. بعد  رشد سلول ها را با استفاده از یک میکروسکوپ invert ببینید. طبق میزان رشدی که وجود دارد، کشت ها می توانند ته نشین بشوند و یا محیط تازه اضافه شود ( محیط تازه اضافی افزوده شده و یا تعویض کامل محیط انجام می شود). مجددا، سوسپانسیون سلولی برای شروع کشت های back-up

مورد استفاده قرار می گیرد. کشت ها را به مدت ۳-۲ روز به حال خود رها کنید، و سپس روزانه با تغییرات محیط در هر ۳-۲  روز آنها را نگاه کنید تا زمانی که برای هاروست آماده می شوند.

اگر کشت ها رشد خیلی آهسته دارند و یا رشد ظاهری ندارند، ارزش آن را دارد که محیط را با محیط  chang عوض کنید تا اینکه میزان رشد را بالا ببرید.  اگر بعد از ۱۴-۱۰ روز هیچ رشد سلولی دیده نشد، به ناچار تکرار نمونه، مثل بالا در نظر گرفته می شود.

 

پروتکل ۲: ساب کالچر با تریپسینه کردن

ساب کالچر در شرایط زیر لازم است.

۱- در صورتی که میزان رشد کم باشد، کلونی ها اجازه دارند که با هم تلاقی کنند و سپس ساب کالچر شوند، به این دلیل که تعداد کشت کافی داده شود و کشت اجازه هاروست داشته باشد.

۲- در کشت های چند تایی لازم است، در صورتیکه تست های اضافی مورد نیاز باشد تریپسینه کردن، یک قسمت کامل از روش هاروست سوسپانسیون است.

مواد و وسایل:

۱-هود لامینر Class2

۲- انکوباتور۳۷ درجه سانتی گراد (CO2  دار یا بدون CO2)

۳- سیلندر گاز

۴- لوله سانتریفوژ

۵- میکروسکوپ inverted

۶- محیط کشت کامل که مناسب است

۷- پتری دیش پلاستیکی

۸- پیپت پاستور پلاستیکی

۹- TV) Trypsin – Versene)

روش کار:

۱-  ابتدا محیط را بیرون بریزد و کشت (flowing  or  running  together) confluentرا با  .۰۵ml محلول (TV) استریل بشوئید.

۲- در این مرحله  ۱-۲ ml محلول (TV) استریل اضافه کنید و در ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۵ دقیقه انکوبه کنید.

۳- در زیر میکروسکوپ invert چک کنید، که سلول ها کاملا  از سطح جدا شدن (detached) و کشت را برای اطمینان از یک سوسپانسیون سلولی بهم بزنید، یک میلی لیتر محیط  کامل برای توقف عمل تریپسین اضافه کنید.

۴- سوسپانسیون را به داخل یک تیوپ ته مخروطی بریزید و به مدت ۵ دقیقه در دور ۲۰۰g سانتریفوژ کنید.

۵- اگر نیاز است، به کشت اصلی، محیط تازه اضافه کنید و یا آن را دور بریزید.

۶- محلول رویی را بیرون بریزید (در شرایط استریل) و pellet  را به آرامی با نوک انگشتان بهم بزنید.

۷- مقدار مناسبی از محیط  به هر کشت اضافه کنید. ( کشتی که reseeded شده) مثلا .۰۵ml  در coverslip,  در تیوپ ۱ml یا در فلاسک ۳ ml.

۸-ظروف کشت تازه را  ressed  کنید، میزان گاز مناسب، در ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه کنید (بهم نخوره) و مینیمم، ۶ ساعت یا overnight همانطوری که مناسب است انکوبه کنید.

نکته: معمولا Versene و تریپسین با هم مخلوط می شوند. ورسین (Versene) برای شستشوی سلول ها  مورد استفاده قرار می گیرد  و مقادیر اندک سرم و تریپسین را بر می دارد و سلول های سوبسترا را جدا می کند.

 

نکات ضروری حین انجام آزمایش

* تریپسین و Versene  چشم ها و سیستم تنفسی و پوست را می سوزاند، و تریپسین می تواند برای دستگاه تنفسی حساسیت ایجاد کند.

* یون های منیزیم و کلسیم موجود در محیط کامل از فعالیت بیشتر تریپسین جلوگیری می کنند.

* اگر کشت ها در coverslip تریپسینه شوند، برای هاروست روز بعد آماده می شوند. سپس بعد از ۶ ساعت، ۱.۵ml محیط اضافه کرده و پروتکل کشت های coverslip هاروست درجا را دنبال کنید.

 

کشت مایع آمنیوتیک – شرایط نمونه گیری و روش کار