مراحل کشت نمونه خون محیطی
اساس کشت بافت
بافت های مختلفی جهت تهیه کروموزوم و تشخیص سیتوژنتیکی استفاده می شوند. انتخاب بافت بسته به بیمار متفاوت است، مثلا برای بالغین و نوزادان از خون محیطی، ولی به میزان کمتری مغز استخوان، پوست و بافت های دیگر استفاده می شود.
فراوان ترین نمونه بافتی در تعداد زیادی از موارد بالینی، برای تشخیص های سیتوژنتیکی، نمونه خون محیطی است. خون محیطی از بیماران در تمامی سنین به راحتی گرفته می شود. روش کار کشت نمونه خون محیطی به این شکل است که، نمونه خون محیطی با یک سرنگ هپارینه 5-2 میلی لیتر از بیمار گرفته می شود. نکته مهم که باید به آن توجه کنیم این است که، نمونه خون محیطی نباید لخته شده باشد و برای جلوگیری از لخته شدن خون از هپارین به عنوان ضد انعقاد، در موقع خونگیری استفاده می شود.
اولین مرحله کشت سلول محسوب می شود با هدف افزایش تعداد سلول های نمونه، که برای این منظور به مواد میتوژن نیاز داریم. میتوژن ها موادی هستند که سلول را تحریک به تقسیم می کنند.
پذیرش و آماده کردن نمونه
فراوان ترین نمونه بافتی در تعداد زیادی از موارد بالینی، برای تشخیص های سیتوژنتیکی، نمونه خون محیطی است. خون محیطی از بیماران در تمامی سنین به راحتی گرفته می شود. روش کار به این شکل است که نمونه خون محیطی با یک سرنگ هپارینه 5-2 میلی لیتری از بیمار گرفته می شود. برای اینکه سلول های خون، میتوز های متوالی انجام دهند، باید تحریک شوند. این تحریک بوسیله فاکتورهای پروتئینی و ویروسی، بعضی از lectin ها استفاده می کنند که به آن ها میتوژن می گویند.
برخی از میتوژن ها شامل موارد زیر می شوند:
- فیتوهماگلوتینین Phytohemagglutinin(PHA)
- میتوژن پکوید (Pokeweed mitogen)
- کانکاوالین آ (Concanavalin A)
- ویروس اپشتین بار Epstein Barr Viruse(EBV)
این میتوژن ها فقط T-cell ها را تحریک می کنند و بر روی B-cell ها اثر کمی دارد یا اثری ندارد. اپشتین بار ویروس، اختصاصا B-cell ها را تحریک می کند (B-cell ها لنفوسیت هایی از سیستم ایمنی بدن هستند که در مقابل پاتوژن هایی مثل ویروس پادتن تولید می کنند. این لنفوسیت ها در ایمنی همورال نقش دارند، که همراه با ایمنی سلولی مکانیسم دفاع اختصاصی تشکیل می دهند).
میتوژن Concanavalin A, pokeweed, و EBV گاهی اوقات به تنهایی و یا با هم برای تحریک B لنفوسیت ها، در نمونه هایی که از بیماران لوسمی بدست آمده بخصوص لوسمی مزمن لنفوئیدی (CCL)ها بکار می روند.
نوع و نحوه نگهداری نمونه های بیمار
نمونه خون را در سدیم هپارین یا لیتیوم هپارین (لوله با درب سبز) جمع آوری و در درجه حرارت اتاق نگهداری می شود.
نمونه های غیرقابل قبول
نمونه های جمع آوری شدن در ماده ضد انعقاد اشتباه مثلا EDTA، نمونه هایی که بیشتر از ۷۲ ساعت مانده باشند، نمونه های کمتر از 1ml یا نمونه هایی که در معرض حرارت قرار گرفته باشند.
بنابراین خون هرگز نباید یخ بزند و یک هفته می توان در قسمت پایین یخچال نگهداری نمود. اگر خون با ماده ضد انعقاد EDTA گرفته شود با سرم فیزیولوژی یا محیط بدون سرم، ۳ بار شستشو داده می شود و سپس با اضافه کردن هپارین کشت داده می شود.
پروتکل کشت خون نمونه
در این مرحله برای بزرگسالان 7 قطره خون بدون سر سوزن 0/4cc، بچه های کوچک 0/3cc، نوزادان و جنین0/2cc ، زنان باردار و تازه فارغ شده 0/5cc ، برای 5 ml محیط کامل استفاده می شود می گردد.
اساس کشت خون محیطی که با PHA تحریک شده
فیتوهماگلوتینین که از لوبیای قرمز استخراج می شود موجب تقسیم گلبول های سفید خون می شود. ماکزیمم زمانی که سلول ها به اندیکس میتوزی می رسند ۶۸ تا ۷۲ است. اضافه کردن کلسمید سلول ها را در مرحله متافاز نگه می دارد سپس سلول ها با استفاده از هایپوتونیک و فیکساتیو هاروست می شوند و در این مرحله است که کروموزوم ها قابل شناسایی هستند.
پروتکل/دستورالعمل کشت خون محیطی
آماده کردن محیط کشت
- محیط کشت( McCoy 5 A یاRPMI 1640 یا Ham’s F10 ) 800cc
- سرم (FBS یا BS) 20cc
- پنی سیلین/ استرپتومایسین (ml/ 10mg and ml / 10,000u) 1cc
- فیتوهماگلوتینین (PHA) 2cc
- ال_ گلوتامین (ml / 2 mg or 200 mM) 1cc
PH نهایئ محیط کشت بایستی کمی قلیایئ یعنی بین 7.4 – 7.6 باشد.
می توان به این محیط کشت، 1ml ، (optimal) 2- mercaptoethanolاضافه کرد و این محیط را در لوله استریل5 ml
تقسیم کنید و آنها را در منفی ۲۰ درجه سانتیگراد فریز نمائید. تقسیم محیط کشت در زیر هود و در کنار شعله و یا در هود laminar در شرایط استریل انجام می شود.
تذکر: پروتکل بر اساس setup هر آزمایشگاه متفاوت است.
دستورالعمل/روش کشت خون
۱-به هر لوله استریل، شامل ml 5 محیط کشت، مقدار مناسب خون را اضافه کنید و برای هر بیمار دو لوله متفاوت از نظر محیط کشت پایه به کار ببرید.
۲-به آرامی محتویات هر لوله کشت را مخلوط کنید. کشت ها را به مدت ۷۲ ساعت (3روز ) در حرارت ۳۷ درجه سانتیگراد، در یک حالت مایل، در اتو انکوبه کنید.
۳- پس از سه روز( ۶۸ تا ۷۲ ساعت پس از شروع کشت) هاروست نمائید.
۴- دربعضی اوقات، مثل مواردی که لنفوسیت ها فعال هستند، به عنوان مثال نوزادان، می شود بعد از دو روز کشت را هاروست نمود (معمولا PHA به کار نمی رود.
در مواردی که چرخه سلولی کند است، مثل بیماران مبتلا به کم خونی فانکونی، می توان کشت را 4 روزه هاروست نمود.
بیشتر بخوانید: