راهنمای جامع تکنیک فلوسایتومتری

تشخیص اجزای مختلف سلولی با استفاده از تکنیک فلوسایتومتری

سلول های موجود در مایعات مختلف بدن از جمله خون، ادرار، مایع مغزی نخاعی با تکنیک فلوسایتومتری مشخص می شوند. در حال حاضر از این روش برای تشخیص بسیاری از بیماری ها استفاده می شود. یک از مهم ترین کاربردهای تکنیک فلوسایتومتری، ایمونوفنوتایپ سلولی است که در این روش با استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال کنژوگه شده با فلوروکروم، مولکول های سطح و درون سلول لیبل می شوند.

نمونه ها شامل سلول یا اجزایی است که در یک مایع به حالت سوسپانسیون در آمدند و به دستگاه فلوسایتومتر وارد می شوند. اساس کار این دستگاه خیلی جالب است. نمونه به صورتی که در حالت ایده آل در یک زمان مشخص جریان ایجاد شده یک سلول باشد از دستگاه عبور می کند در این زمان نور لیزر به سلول برخورد می کند و با پراکندگی نور تابیده شده به سلول ها ، اجزای آنها مشخص می شود.

گاهی اوقات سلول ها با یک مارکر فلوئورسنت نشانه گذاری می شوند. در این موارد اول نور فلوئورسنت جذب و سپس در گروهی از طول موج ها منتشر می شود. فلوسایتومتری از این جهت روش خیلی خوبی است که ده ها هزار سلول می توانند به سرعت مورد بررسی قرار بگیرند و داده های جمع آوری شده با یک کامپیوتر پردازش می شوند.

فلوسایتومتری به صورت روتین در آزمایش های بالینی و تحقیقاتی مورد استفاده قرار می گیرد و از آن برای موارد زیر استفاده می شود:

• تشخیص نوع سلول
• شمارش سلول ها
• تعیین ویژگی های سلولی و عملکرد آن ها
• تشخیص میکروارگانیسم ها
• تشخیص بیومارکر
• تشخیص پروتئین ها و عملکردشان
• تشخیص اختلالات سیستم لنفاوی و گردش خون
• تشخیص ناباروری

کاربرد ایمونوفنوتایپ در تشخیص سرطان های خون و لنف

با استفاده از تکنیک ایمونوفنوتایپ حتی تعداد بسیار کم سلول های سرطانی قابل تشخیص است بنابراین روشی مناسب برای تشخیص سرطان در مراحل اولیه و پیشگیری از گسترش آن می باشد. بدلیل کم و زیاد شدن تعداد پلوییدی و تشخیص محتوای DNA غیرطبیعی در بیشتر سرطان ها، برای سنجش جرم DNA در سلول ها نیز از ایمونوفنوتایپ استفاده می شود.

کاربرد ایمونوفنوتایپ در تشخیص ناباروری

طبق مطالعات پژوهشگران ناباروری با ضعف سیستم ایمنی مرتبط است. گاهی اوقات با معاینات پزشکی علت ناباروری و یا سقط مکرر جنین قابل تشخیص نیست بنابراین تعیین میزان سلول های کشنده طبیعی(Natural Killer Cell) و زیر گروه های لنفوسیت ها با ایمونوفنوتایپ می تواند به تشخیص کمک کند.

برای تشخیص ناباروری هایی که علت مشخصی ندارند، پنل آزمایش ناباروری فلوسایتومتری تحت عنوان Infertility Flow Cytometry Panel توصیه می شود که در آن سایتوکین های مهارکننده در رشد جنین بررسی می شود. این سایتوکین ها عبارتند از CD3+, CD4+, CD5+, CD8+, CD16+, CD19+, CD56+ Cytokine که می توانند مورد بررسی قرار بگیرند.

کاربرد ایمونوفنوتایپ در بیماری های مربوط به نقص سیستم ایمنی بدن

بسیاری از بیماری های مربوط به نقص سیستم ایمنی بدن با عملکرد گلبول های سفید مرتبط است. به عنوان مثال علت بیماری ایدز، کاهش لنفوسیت های +CD4 در خون است. برای درمان این بیماری از تست فلوسایتومتری برای بررسی تعداد لنفوسیت های +CD4 استفاده می شود.

در واقع فلوسایتومتری یک روش و دستگاه فلوسایتومتر وسیله ای برای آنالیز داده های قابل اندازه گیری یک نمونه است. فلوسایتومترهای مدرن قادر به تجزیه و تحلیل هزاران ذره در ثانیه هستند و اگر به عنوان تعیین کننده ی نوع سلول پیکربندی شوند می توانند ذرات را با خواص اپتیکی مشخص با نرخ مشابه مقایسه کنند.

فلوسیاتومتر شبیه به یک میکروسکوپ است، اما تفاوتش این است که  به جای تولید تصویری از سلول، فلوسایتومتری، تعیین ویژگی های مشخص شده ی نوری را بصورت خودکار با کیفیت بالا و بر اساس سلول به سلول ارائه می دهد.

در روش فلوسایتومتری سلول‌ها یا با آنتی بادی‌های مونوکلونال متصل به فلورسنت و یا فلوروکروم های متصل شونده به اجزای سلولی رنگ آمیزی می شوند. این رنگ آمیزی شدن تحت تاثیر عامل های زیادی است مثل اینکه چقدر آنتی بادی اختصاصی است یا اینکه غلظت آنتی ژن روی سطح یا داخل سلول چقدر است و… بعد دستگاه باید بتواند نور لیزر یا فلوئورسنس پراکنده شده را از یک سلول تکی از بین همه ی سلول های دیگر ردیابی کند.

پس تک تک رد شدن سلول ها از مقابل نور خیلی مهم است. همانطور که می دانید سلول های هر نمونه ای را داخل یک مایع به حالت سوسپانسیون در می آورند که آن محیط هم ایزوتونیک و با Ph=3/7 است .

چه کاری باید کرد که سلول ها تک تک رد شوند؟ غلظت سلولی اینجا خیلی مهم است و سلول ها باید غلظتی بین ۱۰ به توان ۵ تا ۱۰ به توان ۶ در هر میلی لیتر داشته باشند. حجم کلی نمونه  هم بین ۱ تا ۲ میلی لیتر معمولا کافی است. ولی اگر بخواهید سلول خاصی را در یک نمونه بررسی کنیم که غلظتش از سلول های دیگه  موجود در آن نمونه خیلی کمتر است، باید اول یک بخشی از آن سلول های بی ربط را حذف کنیم.

فلوسایتومتر، قطر سلول ها را هم اندازه می گیرد اما برای این کار محدودیت دارد و قطر سلول مورد نظر باید بین ۱ تا ۳۰ میکرون باشد. برای سلول هایی با قطر کمتر حساسیت ندارد و قطر بیشتر سلول ها هم که مجرای عبور سلول را می بندد.

نمونه ی خون معمولا بهترین نمونه برای انجام فلوسایتومتری است. چون اندازه ی پلاکت ها ۱ میکرون است و سلول های خونی هم ۶ تا ۱۲ میکرون قطر دارند. علاوه بر این نمونه ی خون خودش حاوی سلول های منفرد است که در پلاسمای خون معلق هستند. به عنوان مثال برای نمونه ی مغز استخوان می شود با پیپت کردن پشت سر هم سلول ها را به صورت سوسپانسیون سلول های منفرد درآورد. اما نمونه های تهیه شده از بافت های جامد یا لنفوئیدی باید اول اتصالات سلول به سلول و سلول به بستر را از دست بدهند و بعد بصورت سوسپانسیون دربیایند.

نکته ی مهم در مورد فلوسایتومتری این است که تا زمان آنالیز نمونه خصوصیات و عملکرد سلول باید در حالت طبیعی و دست نخورده باقی بماند. گاهی لازم است سلول ها را به صورت زنده بررسی کرد تا خصوصیاتی مثل زنده بودن، توانایی فاگوسیتوز و… را بررسی کرد. برای همین این سلول ها باید در محیط فیزیولوژیک رقیق شوند و هرچه سریع تر هم مورد آزمایش قرار بگیرند.

سلول های زنده به مقدار کمتری با آنتی بادی از طریق غیر اختصاصی وصل می شوند. اما برای بعضی ویژگی های دیگه ی سلول مثل بیان آنتی ژن های اختصاصی سلول یا مولکول های چسبندگی نیاز نیست که حتما سلول زنده باشد ولی نباید تغییرات زیادی در ساختمان سلولی اتفاق افتاده باشد.

برای یادگیری تکنیک فلوسایتومتری و  کاربرد آن در آزمایشگاه

از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.

بیشتر بخوانید:

• روش های شناسایی و تشخیص هویت سلول ها
• Flow Cytometry An Overview – NCBI