کاربردهای تکنیک RFLP PCR در آزمایشگاه ژنتیک
یکی از روش های تشخیص جهش ها و پلی مورفیسم ها در ژنوم، تکنیک RFLP PCR با استفاده از آنزیمهای محدودگر است. PFLP مخفف عبارت Restriction Fragment Length Polymorphism است و در واقع برای اثبات شباهت دو مولکول DNA مورد استفاده قرار می گیرد.
تکنیک RFLP PCR روشی آسان و مقرون به صرفه است که به منظور تعیین ژنوتیپ واریانتها و SNPهای داخل گونهای و بین گونهای استفاده می شود. نام دیگر این تکنیک که کمتر مورد استفاده قرار می گیرد CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) می باشد.
اهمیت بررسی جهشها در ژنوم
اهمیت بررسی جهش ها در این است که ژنوم موجودات دارای تفاوتهایی در ردیف بازهایشان هستند که این تغییرات طبیعی که باعث گوناگونی در افراد یک جمعیت میشود جهش یا پلی مورفیسم(تغییراتی که فراوانی یا فرکانس آن در جامعه بیشتر از 1% باشد) را ایجاد می کنند. جهشها از روش های گوناگونی میتوانند منجر به تغییر در فنوتیپ اصلی و بروز صفات جدید یا بیماری ها شوند. به مطالعه شناسایی ارتباط جهشها با بروز یک فنوتیپ خاص مطالعات همبستگی “Association Study” گفته می شود.
اگر یک جهش باعث از بین رفتن یا برعکس باعث به وجود آمدن جایگاه برش برای یک آنزیم محدودگر بشود، از هضم آنزیمی یک قطعه به وسیله ی آن آنزیم می توانیم به حضور یا عدم حضور آن جهش پی ببریم.
پروتکل انجام آزمایش PCR-RFLP
برای انجام این تکنیک در ابتدا باید قطعه مورد نظرمان را که می خواهیم از لحاظ حضور یا عدم حضور آن جهش بررسی کنیم را از طریق PCR تکثیر کنیم اما باید دقت کنیم که پرایمرهایی که برای تکنیک RFLP PCR طراحی می کنیم از جهش و یا SNP ها فاصله مناسبی از دو طرف داشته باشند به گونه ای که طول قطعات حاصل از هضم آنزیمی متفاوت باشد تا قابل تشخیص باشد.
بعد از تکثیر ژن حاوی جهش مورد نظرمان به محصول PCR آنزیم محدود کننده مناسب اضافه می نماییم. آنزیم های برشی دسته ای از آنزیم های اندونوکلئاز به شمار می روند که یک ردیف اختصاصی از بازها را درون مولکول DNA دو رشته ای شناسایی می کنند، سپس در دمای مناسب برای فعالیت آنزیم انکوبه می کنیم و در نهایت تعدادی قطعه با طول متفاوت ایجاد می شود. بعد از این کار نتایج بدست آمده از هضم آنزیمی را با استفاده از الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید یا ژل آگارز با درصد بالا (معمولا 3 درصد) مشاهده می کنیم.
حال نوبت به این می رسد که ببینیم که برای تعیین ژنوتیپ در انسان چگونه از این تکنیک استفاده کنیم؟ از آنجایی که انسان دیپلوئید است و از هر ژن دو آلل دارد، می تواند سه تا ژنوتیپ هموزیگوت موتانت دارای دو آلل جهش یافته، هموزیگوت وحشی دارای دو آلل سالم یعنی جهش نیافته و در نهایت هتروزیگوت یعنی دارای یک آلل سالم و یک آلل جهش یافته داشته باشد.
با استفاده از آنزیم برشی و بررسی قطعات حاصل شده از برش می توانیم پی ببریم که هر فردی چه نوع آللی دارد و آیا هموزیگوت است یا هتروزیگوت و اگه داریم در یک جمعیت افراد را بررسی کنیم فراوانی این ژنوتیپ و در نهایت تاثیر یا عدم تاثیر آن در بروز یک صفت خاص یا بیماری را با استفاده از نرم افزار SPSS آنالیز آماری و بررسی کنیم . لازم به ذکر است که برای توالی بعضی از جهش ها، آنزیم برشی مناسب وجود ندارد بنابراین باید از روش های دیگری استفاده کرد.
برای یادگیری تکنیک RFLP PCR و سایر تکنیک های مورد نیاز برای کار در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.
بیشتر بخوانید: