کاربرد اندازه گیری فعالیت پروتئازی در تشخیص هویت سلول ها
برای بررسی و مقایسه سلول های سرطانی از سلول های سالم، می توان از اندازه گیری فعالیت پروتئازهای مختلف استفاده کرد. بعضی از این پروتئاز ها مخصوص سلول های خاصی هستند. مثلا تریپسین، رنین، کلاژناز و آنتی ژن اختصاصی پروستات توسط سلول های خاص ترشح می شوند. پس قطعا الگوی ترشحی آنها می تواند در تشخیص افتراقی و تعیین منشاء سلول های مختلف مورد استفاده باشد.
گاهی از این پروتئاز ها جهت مصارف صنعتی یا تحقیقاتی استفاده می شود بنابراین شناخت الگوی ترشحی آنها بسیار مهم است. همانطور که می دانید کلاژناز برای جداسازی سریع سلول ها از بافت و تریپسین برای جدا شدن سلول های چسبیده به کف پلیت در آزمایشگاه ضروری هستند.
پروتئازها با توجه به مکانیسم عملکردشان به چهار خانواده ی: سرین پروتئاز ها، متالوپروتئیناز ها، آسپارتیک پروتئازها و سیستئین پروتئازها تقسیم می شوند ولی تعداد کمی شان هم هنوز در خانواده ی خاصی نیستند.
مطالعات نشان می دهد که در بعضی از بیماری ها تعادل بین پروتئازها با مهارکننده های طبیعی آنها بهم می خورد و باعث تخریب بافت یا تغییراتی در ساختمان بافت می شود. پس طبیعیه که تولید مهارکننده های اختصاصی این آنزیم ها جزء پروژه های مهم شرکت های داروسازی قرار بگیرد.
پروتئاز های مترشحه از سلول ها در فرآیند های فیزیولوژیک و پاتولوژیک زیادی مثل التهابات، پاسخ های ایمنی، ترمیم زخم و متاستاز سرطان نقش دارند. در اندازه گیری پروتئازها به مواردی مثل خصوصیات سوبسترا، نوع آنزیم، میزان فعالیت آنزیم و حساسیت روش کار باید توجه کرد. آنزیم ها به روش های مختلفی ازجمله immunoassay (مثل الایزا) قابل اندازه گیری هستند ولی اندازه گیری فعالیت آنها یا اندازه گیری شکل فعالی آنزیم ها اهمیت ویژه ای دارد.
به طورکلی پروتئازها با تاثیر برروی سوبسترای اختصاصی خودشان باعث تجزیه ی آن سوبسترا می شوند. پس با تعیین مقدار محصول در مقایسه با سوبسترای اولیه یا مقایسه میزان محصول در مقابل یک استاندارد می شود میزان فعالیت آنها را تعیین کرد. یکی از روش های اندازه گیری پروتئازها بررسی فعالیت آنزیمی روی سوبسترا های طبیعی آنهاست. مثلا رایج ترین سوبستراهای طبیعی اندوپپتیدازها، کازئین،هموگلوبین و ژلاتین هستند که هم ارزان قیمتند و هم بصورت خالص قابل تهیه هستند.
در صورتی که آنزیم شناخته شده باشد، می شود مناسبترین سوبسترا را انتخاب کرد. مثلا برای کلاژناز که همیشه برای کشت و پاساژ سلول لازم است، بهترین سوبسترا کلاژن است اما اگر نوع آنزیم ناشناخته باشد، با استفاده از اثر دادن آنزیم روی سوبستراهای مختلف می شود به نوع فعالیت پروتئازی سلول و سوبسترای اختصاصی آن پی برد.
برای بررسی ابتدایی فعالیت پروتئولیتیک از یک آزمایش ساده و عمومی استفاده می شود. در این آزمایش به محلول سوبسترا که عمدتا کازئین یا هموگلوبین است، مایع آنزیمی مورد نظر را اضافه کرده و بعد از انکوباسیون به محیط عمل، اسید تری کلرواستیک پنج درصد اضافه می شود تا واکنش متوقف شود و سوبستراهای تجزیه نشده دناتوره شده و از محیط واکنش خارج بشوند.
سپس مایع رویی سانتریفوژ شده و جذب نوری مایع فوق به کمک اسپکتروفوتومتر در طول موج ۲۸۰ نانومتر در مقابل بلانک قرائت می شود. میزان فعالیت آنزیمی با جذب نوری نسبت مستقیم داشته و متناسب با میزان سوبستراهای تجزیه شده ای است که به علت کوچک بودن اندازه با اسید تری کلرواستیک واکنش ندادند.
برای یادگیری تکنیک های مورد نیاز برای آزمایشگاه کشت سلول
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.
اندازه گیری فعالیت پروتئازی استفاده از رنگ کوماسی آبی
این رنگ تمایل به اتصال به پلی پپتیدها دارد. پس می شود برای رنگ آمیزی سوبستراهای تجزیه نشده از آن استفاده کرد. برای انجام این آزمایش به محلول کازئین محلول آنزیمی افزوده و بعد از انکوباسیون، کوماسی آبی اضافه می شود و ده دقیقه بعد جذب نوری در مقابل بلانک و کنترل های مناسب به کمک اسپکتروفوتومتر در طول موج ۵۹۵ نانومتر قرار می گیرد.
یکی دیگر از روش های بررسی فعالیت پروتئاز ها استفاده از کروموفورها (مشتقات رنگی سوبستراهای پروتئینی)
مهمترین کروموفورهایی که استفاده می شوند آزوکول (آزوژلاتین)، آزوکازئین و آزوآلبومین هستند. این مواد در واقع ژلاتین کازئین یا آلبومینی هستند که یک ماده رنگی مخفی به ساختمان آنها اضافه شده. آزوکول سوبسترای مناسبی برای متالوپروتئینازهایی مثل کلاژناز و ژلاتیناز است. آزوکازئین سوبسترای مناسبی برای استرومیلیزین ها و سرین پروتئازهایی مثل پلاسمین است.
استفاده از این مشتقات خیلی ساده ست اما در عین حال نتایج با ارزشی دارد و وابسته به آزادسازی پپتیدهای قرمز رنگ کوچکی است که پس از توقف واکنش و رسوب دادن قطعات درشت تر آزوپروتئین توسط اسید تری کلرواستیک ده درصد و سانتریفوژ دوربالا ، می شود جذب نوری مایع رویی رو در ۴۴۰ نانومتر اندازه گرفت و فعالیت آنزیمی را محاسبه کرد. بنابراین روش کار خیلی ساده و حتی با یه اسپکتروفوتومتر ارزان قیمت هم قابل انجام است.
برای افزایش حساسیت تست می شود از کنژوگه های فلورسانس پلی پپتیدها استفاده کرد که البته خواندن نتایج نیاز به فلوریمتر دارد. تیوپپتولید ماده دیگری است که خیلی حساس تر از آزوکول و آزوکازئین بوده و برای متالوپروتئیناز ها کاملا اختصاصی است. سرین پروتئازهایی مثل فعال کننده های پلاسمینوژن روی تیوپپتولید اثر ندارند، ولی تمام متالوپروتئیناز ها اثر کاملا مشابهی روی این ماده دارند ، پس در صورت استفاده از تیوپپتولید نمی شود گفت که کدام متالوپروتئیناز روی ماده فوق موثر است.
بیشتر بخوانید: