✍ کاربرد رنگ آمیزی تکنیک ایمونوهیستوشیمی در آزمایشگاه های سلولی

این تکنیک در تشخیص سلول های غير طبيعی مثل سلول هاي موجود در تومورهای سرطانی بطور گسترده ای مورد استفاده قرار می گيرد. نشانگرهای مولکولی خاص می توانند حوادث سلولی ویژه ای را مثل تکثیر یا مرگ سلولی (آپوپتوز) مشخص کنند. علاوه بر این از ایمونوهیستوشیمی برای مشخص کردن جایگاه و پراکندگی بیومارکر ها و بیان پروتئین های متفاوت در بخش های مختلف بافت های بیولوژیکی استفاده می شود.

چطور می شود این واکنش بین آنتی ژن و آنتی بادی را طوری طراحی کرد که قابل ردیابی باشد و دیده شود؟

تجسم تعامل آنتی بادی-آنتی ژن را از چند طریق می شود انجام داد. رایج ترین روش این است که، یک آنتی بادی به آنزیمی مثل پراکسیداز کونژوگه می شود که می تواند یک واکنش تولید کننده رنگ را کاتالیز کند (رنگ آمیزی ایمونوپراکسیداز). از طرف دیگر، می شود آنتی بادی را به یک فلوروفور، مثل فلورسئین یا رودامین هم متصل کرد (ایمونوفلورسانس).

یکی از مهمترین و شاید اساسی ترین مراحل ایمونوهیستوشیمی نشان دار کردن نمونه است. آنتی بادی های مورد استفاده برای تشخیص یک سایت ویژه می توانند پلی کلونال (چند قطبی) یا مونوکلونال باشند. آنتی بادی های پلی کلونال با تزریق پروتئینی خاص یا قطعه ی پپتیدی به حیوانات ساخته می شوند و بعد از تحریک پاسخ ایمنی ثانویه ، آنتی بادی ها را از سرم جدا می کنند. برای همین، آنتی بادی های پلی کلونال ترکیبی ناهمگن از آنتی بادی ها هستند که چند تا اپی توپ مختلف را تشخیص می دهند. آنتی بادی های مونوکلونال با تزریق حیوان و بعد از آن گرفتن نمونه مشخصی از بافت ایمنی بدن، جداسازی یک سلول والد و استفاده از لاین نامیرای حاصل از آن سلول برای ایجاد آنتی بادی ساخته می شوند. این باعث می شود که آنتی بادی ها بصورت اختصاصی یک اپی توپ خاص را مشخص کنند.

در استراتژی های تشخیص ایمونوهیستوشیمی، آنتی بادی ها به عنوان معرف های اولیه یا ثانویه طبقه بندی می شوند. آنتی بادی های اولیه روی آنتی ژن مورد نظر سوار شده و معمولا به عنوان نشانگر عمل نمی کنند، اما آنتی بادی های ثانویه روی ایمونوگلوبولین های گونه های آنتی بادی اولیه سوار می شوند. آنتی بادی ثانویه معمولاً به یک مولکول پیوند دهنده مثل بیوتین کونژوگه می شود که بعدا مولکول های گزارشگر را جذب می کند، یا خود آنتی بادی ثانویه مستقیماً به مولکول گزارشگر وصل می شود.

گزارشگر های این تکنیک ایمونوهیستوشیمی چه ویژگی هایی دارند؟

مولکول های گزارشگر بر اساس ماهیت روش تشخیصی شان متفاوت هستند که رایج ترین آن ها روش کروموژنیک و روش تشخیص فلورسانس به واسطه آنزیم یا یک فلوروفور است. با گزارشگرهای کروموژنیک، یک آنزیم نشاندار شده با یک سوبسترا واکنش نشان می دهد تا محصولی به شدت رنگی تولید کند که با یک میکروسکوپ نوری معمولی قابل تجزیه و تحلیل باشد. در حالی که لیست سوبستراهای آنزیم گسترده است، آلکالین فسفاتاز (AP) و horseradish peroxidase (HRP)  دو آنزیمی هستند که بیشتر به عنوان نشانگر برای تشخیص پروتئین مورد استفاده قرار می گیرند.

 روش های شناسایی آنتی ژن هدف

روش مستقیم یک روش رنگ آمیزی تک مرحله ای است و شامل یک آنتی بادی نشاندار شده به عنوان مثال آنتی سرم کونژوگه شده (FITC) است که به طور مستقیم با آنتی ژن در قطعه های بافت واکنش نشان می دهد. در این روش از تنها یک آنتی بادی استفاده می شود و بنابراین روش ساده و سریعی است، اما برخلاف روش های غیرمستقیم ، حساسیت آن کمتر است. با این حال، این استراتژی کمتر از روش چند فاز استفاده می شود.

روش غیر مستقیم شامل یک آنتی بادی اولیه بدون نشانگر (لایه اول) است که به آنتی ژن هدف در بافت متصل می شود و یک آنتی بادی ثانویه دارای نشانگر (لایه دوم) که با آنتی بادی اولیه واکنش نشان می دهد. همانطور که در بالا گفتیم، آنتی بادی ثانویه باید بر روی IgG گونه های جانوری که در آن آنتی بادی اولیه قرار گرفته ، سوار شود. این روش نسبت به روش مستقیم حساسیت بیشتری دارد. روش غیرمستقیم، جدا از حساسیت بیشتری که دارد، این مزیت را دارد که فقط باید تعداد نسبتاً کمی از آنتی بادی های ثانویه کونژوگه شده (نشانگر دار شده) استاندارد تولید شود. به عنوان مثال، یک آنتی بادی ثانویه دارای نشانگر سوار شده روی IgG خرگوش، که می شود آن را بصورت فوری تهیه کرد، با هر آنتی بادی اولیه ای که در خرگوش پرورش پیدا می کند مفید است. با روش مستقیم ، لازم است هر آنتی بادی اولیه را برای هر آنتی ژن مورد نظر نشاندار کرد.

تکنیک ایمونوهیستوشیمی (IHC) – بخش اول

تکنیک ایمونوهیستوشیمی (IHC )– بخش دوم

تکنیک ایمونوهیستوشیمی (IHC )– بخش سوم