ایمونوهیستوشیمی (IHC) از رایج ترین تکنیک های مرتبط با رنگ آمیزی ایمونولوژیک هست. این تکنیک رو می تونیم این طوری تعریف کنیم: فرآیند شناسایی انتخابی آنتی ژن ها (پروتئین ها) داخل سلول های بخشی از بافت با استفاده از آنتی بادی هایی که بطور اختصاصی به آنتی ژن های سلول ها در بافت های بیولوژیکی متصل میشن‌. ایمونوهیستوشیمی اسم خودش رو از دو واژه ی Immuno )  که به آنتی بادی های مورد استفاده برمی گرده) و  histo) به معنی بافت) گرفته.

درسال ۱۹۴۱ Albert Coons موفق شد برای اولین بار این روش رو ابداع و اجرایی کنه.

 

رنگ آميزي ايمونوهيستوشيمی در تشخيص سلول هاي غير طبيعي مثل سلول هاي موجود توی تومورهاي سرطاني بطور گسترده ای مورد استفاده قرار مي گيره.

نشانگرهای مولکولی خاص می تونن حوادث سلولی ویژه ای رو مثل  تکثیر یا مرگ سلولی (آپوپتوز) مشخص کنن.

علاوه بر این از ایمونوهیستوشیمی برای مشخص کردن جایگاه و پراکندگی بیومارکر ها و بیان پروتئین های متفاوت در بخش های مختلف بافت های بیولوژیکی استفاده می شود.

اما چطور میشه این واکنش بین آنتی ژن و آنتی بادی رو طوری طراحی کرد که قابل ردیابی باشه و بشه دیدش؟

تجسم تعامل آنتی بادی-آنتی ژن رو از چند طریق میشه انجام داد. رایج ترین روشش این هست که، یک آنتی بادی به آنزیمی مثل پراکسیداز کونژوگه میشه که می تونه یک واکنش تولید کننده رنگ رو کاتالیز کنه ( رنگ آمیزی ایمونوپراکسیداز).

از طرف دیگه، میشه آنتی بادی رو به یک فلوروفور، مثل فلورسئین یا رودامین هم متصل کرد (ایمونوفلورسانس).

 

برای ایمونوهیستوشیمی آماده سازی نمونه خیلی مهمه.

لازمه که مورفولوژی سلول، ساختار بافت و آنتیژنیسیتی اپیتوپ های هدف حفظ بشه.

 

این امر به جمع آوری، تثبیت و برش مناسب بافت نیاز دارد. محلول پارافورمالدئید اغلب برای فیکس و تثبیت بافت استفاده میشه، اما روش های دیگه ای هم ممکن هست استفاده بشن.

بسته به هدف آزمایش یا نوع بافت، ممکن هست بافت مورد نظر برش داده بشه و یا به طور کامل استفاده بشه. قبل از برش، نمونه بافت داخل یک محیط مثل موم پارافین یا کرایو مدیا قرار داده میشه. قطعات رو میشه بر روی انواع سازه ها، مثلا میکروتوم، کرایوستات یا ویبراتوم  برش داد.

 

نمونه ها به طور معمول در محدوده 3 تا 5 میکرومتر قطعه قطعه می شن. برش ها بر روی اسلایدها سوار می شن، و با استفاده از شستشوی الکل با غلظت های افزایشی ( یعنی به ترتیب 50٪ ، 75٪ ، 90٪ ، 95٪ ، 100٪) آب موجود در نمونه از بین میره و پاک میشه. قبل از تصویربرداری در زیر میکروسکوپ باید از مواد شوینده مثل زایلن استفاده کرد.

بسته به روش تثبیت و حفظ بافت، ممکن هست نمونه اقدامات اضافی لازم داشته باشه تا اپی توپ ها برای اتصال بع آنتی بادی در دسترس قرار بگیرن. مثلا دپارافینیزاسیون یعنی حذف پارافین و بازیابی آنتی ژن ها از اقدامات معمول به حساب میاد. برای بافت های تثبیت شده در فرمالین که توی پارافین قرارگرفتن، بازیابی آنتی ژن اغلب ضروری هست و شامل تیمار با گرما یا پروتئیناز میشه. این مراحل ممکن هست باعث تفاوت بین رنگ آمیزی یا عدم رنگ آمیزی آنتی ژنهای هدف بشه.

توی مرحله ی بعدی باید رنگ آمیزی های غیر اختصاصی ایمونو رو حذف کنیم.

بسته به نوع بافت و روش تشخیص آنتی ژن، ممکن هست از بیوتین اندوژنز یا آنزیم هایی به ترتیب برای مسدود یا خاموش کردن قبل از رنگ آمیزیِ آنتی بادی استفاده بشه. اگرچه آنتی بادی ها دارای درجه خلوص ترجیحی برای اپی توپ های خاص هستن، و ترجیحشون برای اتصال به اهداف مشخصشون بیشتره اما ممکنه  به طور جزئی یا ضعیف به سایت هایی در پروتئین های غیر اختصاصی متصل بشن (که به اون مکان های واکنشی هم گفته میشه) که مشابه سایت های اتصال دهنده مربوط به آنتی ژن هدف هستن.

اتصال غیر اختصاصی در مقادیر بالا، باعث رنگ آمیزی زیاد پس زمینه  می شه که شناسایی آنتی ژن هدف رو با مشکل مواجه می کنه. برای کاهش رنگ آمیزی پس زمینه در IHC ، ICC و سایر روشهای رنگ آمیزی ایمنی، نمونه ها با یک بافر انکوبه میشن که سایتهای واکنشی رو که آنتی بادی های اولیه یا ثانویه ممکنه به اون ها متصل بشن ، مسدود می کنه.

بافرهای مسدود کننده معمول شامل سرم نرمال، شیر خشک بدون چربی، BSA یا ژلاتین هست. البته بافرهای مسدود کننده تجاری با فرمولاسیون اختصاصی برای بهره وری بیشتر در دسترس هستن. روش های از بین بردن رنگ آمیزی پس زمینه شامل رقیق شدن آنتی بادی های اولیه یا ثانویه، تغییر زمان یا دمای انکوباسیون و استفاده از سیستم تشخیص متفاوت یا آنتی بادی اولیه ی متفاوت هست.

انجام تست کنترل مثبت ( آزمایش برروی بافت شناخته شده ای که آنتی ژن خاص رو بیان می کنه) و کنترل منفی (آزمایش برروی بافت شناخته شده ای که آنتی ژن خاص رو بیان نمی کنه ) باید انجام بشه.

بقیه ی مراحل ایمونوهیستوشیمی رو در مطالب بعدی باهم یاد می گیریم.

 

سپاس از همراهیتون