کاربرد تکنیک VNTR PCR و انگشت نگاری DNA
تکنیک VNTR PCR، به معنای PCR نواحی VNTR در ژنوم به خاطر آنالیز و مقایسه ی آنهاست که اساس تکنیک انگشت نگاری DNA می باشد که اولین بار توسط پروفسور Alec Jeffrey درسال 1984 معرفی گردید. لازم به ذکر است در ابتدا VNTR ها توسط آنالیز RFLP شناسایی شدند.
تعریف VNTR
در ژنوم همه ما نواحی وجود دارد که بسیار متغیر و دارای توالی های تکراری است که به این نواحی (Variable Number Tandem Repeats) VNTR یا مینی ستلایت (minisatellite) گفته می شود که به طور عمده عملکرد ویژه ای ندارند. در حالت طبیعی VNTR ها دارای 20 تا 100 نوکلئوتید تکراری و پشت سرهم می باشند که این طول و تعداد تکرارها در افراد مختلف به جز در دو قلوهای همسان، متفاوت است بنابراین می توان از آن ها به عنوان مارکری برای شناسایی DNA افراد استفاده کرد.
مزیت استفاده از VNTR ها در مقایسه با SNP های دو آللی به این دلیل است که VNTR ها چند آللی بوده و الگوی وراثتی آن ها مندلی و از نوع هم قالبی است بنابراین تعدادی از تکرار های شناسایی شده در افراد می تواند با پدر و مادرشان مشترک باشد. از دیگر مزیت ها این است که این توالی های تکراری معمولا در نواحی غیر کد کننده DNA هستند و استفاده از آن ها باعث برملا شدن نواحی ژنی افراد نمی شود و حریم خصوصی افراد حفظ می شود.
در تجزیه و تحلیل داده های VNTR می توان از دو اصل ژنتیکی اساسی استفاده کرد:
- تطبیق هویت
هر دو آلل VNTR از یک مکان خاص باید مطابقت داشته باشند. اگر دو نمونه از یک فرد باشند، باید الگوی الل یکسانی را نشان دهند.
- تطبیق وراثت
آلل های VNTR باید از قوانین وراثت پیروی کنند. در تطبیق یک فرد با والدین یا فرزندانش، فرد باید آللی داشته باشد که با یکی از والدین مطابقت داشته باشد. اگر رابطه دورتر است، مانند پدربزرگ و مادربزرگ یا خواهر یا برادر، آنگاه مطابقت ها باید با درجه خویشاوندی سازگار باشد.
دستورالعمل انجام VNTR PCR
در تکنیک VNTR PCR یا انگشت نگاری ابتدا با استفاده از آنزیم های محدودکننده در اثر هضم آنزیمی به دلیل تفاوت در تعداد تکرار ها در افراد مختلف قطعاتی با طول مختلف حاصل می شود که این قطعات در ژل آگارز و طی ساترن بلاتینگ به غشا نیتروسلولزی انتقال داده می شوند.
بعد از اینکه قطعات روی غشا تثبیت شدند از پروب های لیبل شده با رادیواکتیو، DNA با واحد های تکرار شونده که در تمام لوکوس VNTR ثابت می باشند هیبرید ایجاد می کنند و چنانچه غشا را در مقابل X-ray قرار دهیم سیگنال های رادیواکتیو ایجاد می شود که الگویی از VNTR ها برای ما فراهم می کند. این پروسه طولانی است از این رو امروزه از VNTR-PCR به عنوان روش جایگزین استفاده می شود.
در روش VNTR PCR اختصاصیت و حساسیت آنالیز VNTR افزاش پیدا کرده و حتی مقادیر بسیار اندکی از خون، منی و یا مو برای انگشت نگاری DNA کفایت می کند. به منظور انجام این تکنیک ابتدا پرایمر های اختصاصی برای نواحی احاطه کننده لوکوس های VNTR طراحی می شود که یکی از پرایمرها با رنگ فلورسنت لیبل می شود. سپس PCR انجام می شود و از آن جایی که تعداد تکرار ها در افراد متفاوت می باشد قطعاتی با طول مختلف ایجاد می شود که مقایسه طول هر یک برای تشخیص هویت قابل استفاده است سپس این نوارها با ژل الکتروفورز مشاهده و مقایسه می شوند.
بهتر است به دلیل نزدیک بودن نوارهای حاصل از لوکوس های چند گانه از ژل پلی آکریل آمید و الکتروفورز Capillary استفاده شود.
انواع VNTRها
(AMP-FLP) amplified fragment lenght polymorphism: با طول واحدهای تکرار بزرگتر که حدود 350 تا 1000 نوکلئوتید هستند.
STR ها short tandem repeats: با طول 100 تا 300 نوکلئوتید در ژنوم که بسیار پراکنده و پلی مورفیک هستند و طول هر تکرار 2 تا 6 نوکلئوتید و تعداد تکرارها در یک لوکوس 4 تا 40 بار است و از آن جایی که کوچک هستند حتی نمونه های DNA قدیمی و تجزیه شده آنها هم می توانند برای یک PCR مورد استفاده قرار بگیرند و به همین دلیل معمولا در مطالعات جنایی مورد استفاده قرار می گیرند.
STR ها با این که کوچک اند اما تعداد لوکوس های فراوانی از آن ها در ژنوم هر فرد است و هر قدر تعداد لوکوس بیشتری آنالیز شود نتیجه حاصل قابل اطمینان تر است. برای تکثیر چند لوکوس STR به طور همزمان می توان از Multiplex PCR استفاده کرد که در یک واکنش PCR چندین پرایمر متفاوت استفاده می شود ولی دقت و اختصاصیت آن نسبت به بررسی تنها یک لوکوس STR پایین تراست اما به مراتب ساده تر و کم هزینه تر است. امروزه کیت های تجاری به بازار عرضه شده که امکان بررسی 13 لوکوس STR را به طورهمزمان فراهم می کند.
کاربردهای روش VNTR
استفاده در تجزیه و تحلیل ژنتیکی: VNTR ها منبع مهمی از نشانگرهای ژنتیکی RFLP بودند که در تجزیه و تحلیل و نقشه برداری ژنوم های دیپلوئید استفاده می شوند. در حال حاضر که بسیاری از ژنوم ها توالی یابی شده اند، استفاده از VNTR ها از طریق انگشت نگاری DNA و پایگاه داده CODIS برای تحقیقات جرم شناسی و پزشکی قانونی ضروری شده است.
هنگامی که پرایمر های اختصاصی برای نواحی احاطه کننده لوکوس های VNTR طراحی می شود و لیبلینگ پرایمر با رنگ فلورسنت انجام می شود و PCR را می گذاریم، اندازه ها با ژل لکتروفورز یا ساترن بلات تعیین میشود که در نتیجه ی آن الگوی باندهای منحصر به فرد برای هر فرد تولید میشود. وقتی با گروهی از نشانگرهای مستقل VNTR آزمایش شد، احتمال اینکه دو فرد نامرتبط دارای الگوی آللی یکسان باشند بسیار کم است.
از VNTRها برای مطالعه تنوع ژنتیکی و الگوهای اصلاح نژادی در جمعیت حیوانات وحشی یا اهلی نیز استفاده می شود.
VNTR ها را می توان برای تشخیص سویه های پاتوژن های باکتریایی استفاده کرد. در زمینه میکروبیولوژی پزشکی، چنین سنجش هایی آنالیز Multiple Loci VNTR یا MLVA نامیده می شوند.
بیشتر بخوانید: