✍ کاربرد تکنیک VNTR-PCR و انگشت نگاری DNA 

تکنیک VNTR-PCR ، به معنای PCR نواحی VNTR در ژنوم به خاطر آنالیز و مقایسه ی آنها  هست که اساس تکنیک انگشت نگاری DNA می باشد که اولین بار توسط پروفسور Alec Jeffrey درسال ۱۹۸۴ معرفی گردید البته در  ابتدا VNTR ها توسط آنالیز RFLP شناسایی شدند.

تعریف VNTR 

در ژنوم همه ما نواحی وجود دارد که بسیار متغیر و دارای توالی های تکراری است که به این نواحی VNTR یا مینی ستلایت ( minisatellite ) گفته می شود که به طور عمده عملکرد ویژه ای ندارند.

در حالت طبیعی VNTR ها دارای ۲۰ تا ۱۰۰ نوکلئوتید تکراری و پشت سرهم می باشند. که این طول و تعداد تکرارها در افراد مختلف به جز در دو قلوهای همسان، متفاوت است بنابراین می توان از آن ها به عنوان مارکری برای شناسایی DNA افراد استفاده کرد. مزیت استفاده از VNTR ها در مقایسه با SNP های دو آللی به این دلیل است که VNTR ها چند آللی بوده و الگوی وراثتی آن ها مندلی و از نوع هم قالبی است بنابراین تعدادی از تکرار های شناسایی شده در افراد می تواند با پدر و مادرشان مشترک باشد. از دیگر مزیت ها این است که این توالی های تکراری معمولا در نواحی غیر کد کننده DNA هستند و استفاده از آن ها باعث بر ملا شدن نواحی ژنی افراد نمی شود و حریم خصوصی افراد حفظ می شود.

در تکنیک های انگشت نگاری ابتدایی با استفاده از آنزیم های محدودکننده ابتدا در اثر هضم آنزیمی به دلیل تفاوت در تعداد تکرار ها در افراد مختلف قطعاتی با طول مختلف حاصل می شود که این قطعات در ژل آگارز و طی ساترن بلاتینگ به غشا نیتروسلولزی انتقال داده می شوند. بعد از این که قطعات روی غشا تثبیت شدند از پروب های لیبل شده با رادیواکتیو، DNA با واحد های تکرار شونده که در تمام لوکوس VNTR ثابت می باشند هیبرید ایجاد می کنند و چنانچه غشا را در مقابل X-ray قرار دهیم  سینگنال های رادیواکتیو ایجاد می شود که الگویی از VNTR ها برای ما فراهم می کند پس می توان گفت این پروسه طولانی است از این رو امروزه از VNTR-PCR استفاده می کنیم.

در روش PCR-VNTR اختصاصیت و حساسیت آنالیز VNTR افزاش پیدا کرده و حتی مقادیر بسیار اندکی از خون، منی و یا مو برای انگشت نگاری DNA کفایت می کند. به منظور انجام این تکنیک ابتدا پرایمر های اختصاصی برای نواحی احاطه کننده لوکوس های VNTR طراحی می شود که یکی از پرایمرها با رنگ فلورسنت لیبل می شود .سپس PCR انجام می شود و از آن جایی که تعداد تکرار ها در افراد متفاوت می باشد قطعاتی با طول مختلف ایجاد می شود که مقایسه طول هر یک برای تشخیص هویت قابل استفاده است سپس این نوارها با ژل الکتروفورز مشاهده و مقایسه می شوند که بهتر است به دلیل نزدیک بودن نوارهای حاصل از لوکوس های چند گانه از ژل پلی آکریل آمید و الکتروفورز Capillary استفاده شود.

 VNTR ها دو دسته هستند

 AMP-FLP ها amplified fragment lenght polymorphism با طول واحدهای تکرار بزرگتر که حدود ۳۵۰ تا ۱۰۰۰ نوکلئوتید هستند.

STR ها short tandem repeats با طول ۱۰۰ تا ۳۰۰ نوکلئوتید در ژنوم که بسیار پراکنده و پلی مورفیک هستند و طول هر تکرار ۲ تا ۶ نوکلئوتید و تعداد تکرارها در یک لوکوس ۴ تا ۴۰ باراست و از آن جایی که کوچک اند حتی نمونه های DNA قدیمی و تجزیه شده هم می توانند برای یک PCR موفق مورد استفاده قرار بگیرند و به همین دلیل معمولا در مطالعات جنایی مورد استفاده قرار می گیرند. STR ها با این که کوچک اند اما تعداد لوکوس های فراوانی از آن ها در ژنوم هر فرد است و هر قدر تعداد لوکوس بیشتری آنالیز شود نتیجه حاصل قابل اطمینان تر است. برای تکثیر چند لوکوس STR به طور همزمان می توان از Multiplex PCR استفاده کرد که در یک واکنش PCR چندین پرایمر متفاوت استفاده می شود ولی دقت و اختصاصیت آن نسبت به بررسی تنها یک لوکوس STR پایین تراست ولی به مراتب ساده تر و کم هزینه تر است. امروزه کیت های تجاری به بازار عرضه شده که امکان بررسی ۱۳ لوکوس STR را به طورهمزمان فراهم می کند.