✍ دستورالعمل تست TSI برای شناسایی گروه انتروباکتریاسه

آزمایش TSI برای شناسایی اعضای خانواده انتروباکتریاسه به کار می رود. همچنین این تست برای افتراق انتروباکتریاسه از سایر باسیل های روده ای گرم منفی استفاده می شود. محیط کشت TSI حاوی ۱ درصد لاکتوز، ۱ درصد ساکارز و ۱/۰ درصد گلوکز می باشد. اختلاف در غلظت این قند ها به منظور تشخیص توانایی مصرف آنها است. معرف فنول رد به عنوان شاخص PH تغییرات اسیدیته محیط را که نتیجه تخمیر کربوهیدرات ها می باشد، نشان می دهد. بطوری که تولید اسید ناشی از تخمیر قند را با تغییر رنگ قرمز به زرد نشان می دهد.در این محیط تیوسولفات سدیم و سولفات آهن ll نیز وجود دارد، تیوسولفات سدیم سوبسترای تولید H2S و سولفات آهن به عنوان معرف رنگی عمل می کند و در حضور H2S رسوب رنگی تشکیل می دهد.

البته می توان برای بررسی الگوی مصرف قند و تولید گاز H2S از محیط Kligler Iron Agar نیز استفاده نمود. در محیط اخیر تست های مشابه محیط TSI قابل انجام است. کشت در محیط TSI به صورت کشت عمقی و کشت سطحی زیگزاگ در سطح شیبدار انجام می گیرد. سپس به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت در ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری و سپس از نظر تخمیر قندی، تولید گاز و تولید H2S مورد بررسی قرار می گیرند. واکنش های محیط TSI به اشکال زیر مشاهده می شود:

۱.سطح شیبدار قرمز (قلیایی) و عمق لوله زرد (اسیدی)- در این حالت فقط گلوگز تخمیر شده است و تولید مقادیر اندک اسید باعث تغییر رنگ محیط به زرد می شود، از آنجایی که غلظت گلوکز کم است، به سرعت تمام شده و باکتری برای تامین انرژی مورد نیاز خود از ترکیبات دیگر محیط استفاده می کند، در چنین مواردی اگر باکتری توانایی تخمیر لاکتوز را نداشته باشد از ترکیبات پیتونه استفاده کرده و با تولید یون آمونیوم باعث قلیایی شدن سطح شیبدار محیط کشت و تغییر رنگ قرمز این ناحیه می گردد ولی به دلیل کمبود اکسیژن در بخش عمیق لوله رشد باکتری کند بوده و به همین جهت بخش عمیق لوله همچنان زرد رنگ باقی می ماند.

۲.سطح شیبدار زرد (اسیدی) و عمق لوله زرد( اسیدی)-این حالت نشان دهنده تخمیر لاکتوز و یا ساکارز می باشد و به علت غلظت بالای این دو قند و تولید مقادیر زیاد اسید، کل محیط به رنگ زرد در می آید.

۳.سطح شیبدار قرمز(قلیایی) و عمق لوله قرمز(قلیایی)-این حالت نشان می دهد که هیچکدام از قند های محیط تخمیر نشده و تولید اسید، گاز و گاز H2S منفی است. بجای آن پیتون ها تحت شرایط هوازی یا بی هوازی مصرف شده و با تولید آمونیاک باعث قلیایی شدن محیط می شود.

۴. شکستن، ترک خوردن و یا بالا آمدن محیط کشت در داخل لوله- این حالت نشان دهنده تولید گاز متعاقب تخمیر قندی می باشد و باکتری هایی که از تخمیر قند، اسید و گاز تولید می کنند، ضمن اسیدی کردن محیط (رنگ زرد) باعث ترک خوردگی یا بالا آمدن محیط می گردند.

۵.سیاه شدن محیط کشت-برخی باکتری ها تیوسولفات سدیم را به سولفیت و گاز H2S احیا می کنند و گاز H2S در حضور سولفات آهن رسوب سیاه رنگ سولفید آهن را ایجاد می کند.

واکنش های بیوشیمیایی انتروباکتریاسه در محیط TSI

محیط Kliger Iron Agar

این محیط نیز همانند محیط TSI جهت افتراق اعضاء خانواده انتروباکتریاسه بر پایه توانایی تخمیر دکستروز (گلوکز) و لاکتوز و تجزیه سولفید ها به کار می رود. محیط کشت KIA علاوه بر پیتون، محتوی لاکتوز و دکستروز است، ولی ساکارز ندارد و در طی تخمیر این قند ها و تولید اسید، رنگ محیط از قرمز به زرد تغییر می یابد.در این محیط غلظت دکستروز ۱۰ درصد غلظت لاکتوز است. تیوسولفات سدیم موجود در محیط به عنوان سوبسترا تولید سولفید هیدروژن را میسر می سازد. نحوه کشت میکروب و تفسیر واکنش های بیوشیمیایی این محیط شبیه محیط TSI می باشد.

پروتکل/روش انجام آزمایش

1. ابتدا مشخصات باکتری را روی لوله های حاوی محیط TSI بنویسید
2. در شرایط استریل و با استفاده از آنس نوک تیز(نیدل) عمق لوله را به صورت خط عمود و سطح شیبدار را به صورت زیگزاک کشت دهید.
3. به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کنید
4. پس از سپری شدن زمان انکوباسیون لوله ها را ز نظر واکنش های مختلف شیمیایی مورد بررسی قرار دهید

نکات مهم در حین انجام آزمایش

1. درب لوله های کشت TSI و KIA را پس از تلقیح محکم نبندید، شل بستن درب لوله و تبادل هوا باعث بالا بردن شرایط قلیایی در سطح شیبدار می شود، زیرا اگر در پیچ لوله محکم بسته شود، یک واکنش اسیدی که فقط با تخمیر گلوکز ایجاد شده، سطح شیبدار را نیز در بر می گیرد.
2. در صورتیکه ته لوله سیاه رنگ شود(در نتیجه تولید H2S) و رنگ قرمز یا زرد آن مشخص نباشد، آن را به عنوان رنگ زرد (اسیدی) در نظر بگیرد.
3. به منظور دستیابی به نتایج صحیح لوله TSI را طی ۱۸ تا ۲۴ ساعت پس از انکوباسیون مورد بررسی قرار دهید، زیرا در طی این فاصله زمانی هرگز سوبسترای قندی باکتری تمام نشده و باکتری برای تامین انرژی خود از پیتون ها استفاده نکرده است.
4. برخی از ارگانیسم ها ممکن است تولید سولفید هیدروژن را روی KIA نشان دهند، اما روی TSI نشان ندهند، چون استفاده از ساکارز در محیط TSI فعالیت آنزیمی را که در طی تولید H2S اثر می گذارند را مهار می کند. به ویزه سالمونلای تولید کننده H2S و بعضی از اعضاء انتروباکتریاسه نمی توانند روی محیط TSI تولید H2S نمایند.
5. سولفات آهن موجود در محیط TSI گاهی دارای حساسیت کمتری نسبت به سایر نمک های فریک می باشد. بنابراین ممکن است در ایجاد H2S در TSI و KIA با سایر محیط های کشت SIM مغایرت هایی دیده شود.

جدول زیر واکنش های بیوشیمیایی انتروباکتریاسه در محیط TSI را نشان می دهد

 باکتری های خانواده انتروباکتریاسه

تست های مهم گروه باکتریایی انتروباکتریاسه – بخش اول

تست های مهم گروه باکتریایی انتروباکتریاسه – بخش دوم

آزمایش TSI برای شناسایی اعضای خانواده انتروباکتریاسه