رفع مشکلات آزمایش کاریوتایپ (Troubleshooting)
رفع مشکل یا عیب یابی فرآیندی تعریف شده از تجارب قبلی و پیش گیرنده از اشتباهات رایج و تکراری، با درک از اتفاقات مورد انتظار است که در آن از تکنیک های تحلیلی استفاده می شود تا با توجه به آن ها، مشکلات احتمالی که ممکن است منجر به خروجی غلط از یک آزمایش شوند را رفع کرد.
اصل اساسی در عیب یابی، این است که ابتدا از ساده ترین و محتمل ترین مشکلات ممکن که عمدتا با آن ها مواجه می شویم، شروع کنید و دوم اینکه احتمال وجود بیش از یک خطا، حتی در آزمایش های ساده را در نظر بگیرید. عیب یابی همچنین می تواند به صورت یک چک لیست سیستماتیک و استاندارد یا نمودار و جدولی باشد که قبل از بروز مشکل تهیه شده است.
در این مقاله آموزشی مشکلات و خطاها، دلایل احتمالی ایجاد آن ها در حین انجام آزمایش کاریوتایپ و راه حل های رفع آن ها را بررسی می کنیم و بدانیم برای رفع مشکلات آزمایش کاریوتایپ چه راهکارهایی را استفاده نماییم.
-
مشکل اول: کروموزوم نداریم و یا کروموزوم خرد شده داریم.
اولین علت مشکل:
سلول ها در مرحله هاروست شکسته شده اند، بنابراین بیمار فوت شده یا در حال مرگ و یا تحت بیهوشی است و یا سلول های سینکرونه شده هستند(سلول های هاروست شده ای هستند با زمان آزاد سازی نادرست)
راه حل:
– با زمان های آزاد سازی مختلف آزمایش کنیم.
– هاروست را با اضافه کردن آرام فیکساتیو یا هایپوتونیک، فیکساتیو سرد، کاهش حجم یا زمان هایپوتونیک تکرار کنیم.
دومین علت مشکل:
زمان تهیه اسلاید سلول های شکسته شده، کروموزوم های آن ها پخش شده اند.
راه حل
– تغییر روش های تهیه اسلاید(قطره را از فاصله پائین تر بیندازید و یا زاویه اسلاید را طی پرتاب و خشک شدن افزایش دهید)
– غلظت متانول را در فیکساتیو افزایش دهید
– اسلاید را یک شب در فیکساتیو سرد و در یخچال بگذارید
– منتظر یک روز یا مدتی از روز، با بیشترین رطوبت باشید
– سعی کنید اسلایدها را خشک کنید.
– جریان فیکس کمتر باشد
– با پیپت کوچکتری کار کنید
– از پنجره و فن و باد کولر دور باشید
– در طی خشک شدن اسلایدها را گرم کنید
-
مشکل دوم: کروموزوم های جمع و مچاله شده داریم
اولین علت مشکل:
مدت زیادی در برابر بازدارنده میتوتیک قرار گرفته و یا هایپوتونیک خیلی غلیظ و با غلظت اشتباه بکار رفته است
راه حل:
– هاروست را تکرار کنید، دوره زمانی بازدارنده میتوتیک را قطع کنید. هاروست را با غلظت های مختلف هایپوتونیک، تکرار کنید.
دومین علت مشکل:
هایپوتونیک در حجم کم و ناکافی است.
راه حل:
– سعی کنید غلظت اسید استیک، فیکساتیو را افزایش دهید، غلظت سلول را در فیکساتیو رقیق کنید و اگر لازم است هاروست را تکرار کنید.
سومین علت مشکل:
میتوژن (PHA) بیش از حد کافی است و حالت overdose رخ داده است.
راه حل:
– خون را دوباره کشت دهید، از میتوژن در غلظت های متفاوتی استفاده کنید.
چهارمین علت مشکل:
نمونه ای که از بیمار بدست آمده چند تا حالت ممکن است داشته باشد، یا بیمار در حال مرگ بوده، یا بیمار مرده، و یا بیمار تحت بیهوشی یا تحت درمان با فنوباربیتال (نوزادان)، و یا بیمار .ی که مریض، بیمار سوء تغذیه دارد، یا باردار است.
راه حل:
– مشخصات و پرونده پزشکی بیمار مورد بررسی قرار بگیرد.
پنجمین علت مشکل:
درجه انکوباتور خیلی بالا باشد(البته در مورد خون)
راه حل:
– سعی کنید پیش از انجام کشت لنفوسیت ها را جدا کنید و بشوئید.
– درجه انکوباتور را که باید بین ۳۷-۳۶ درجه سانتی گراد باشد حتما چک کنید. و در درجه حرارت صحیح، دوباره کشت دهید و هاروست کنید.
-
مشکل سوم: متافازها درون سیتوپلاسم اند و سیتوپلاسم باقی مانده قابل مشاهده است.
اولین علت مشکل:
سلول های سینکرونیزه شده یعنی زمان آزاد سازی بلوک سلولی نادرست است و سلول ها تصادفی آزاد نشدن و فقط سلول های مقاوم به سینکرونی تقسیم شده اند.
راه حل:
– با زمان های آزاد سازی مختلف امتحان کنید، تایمیدین و عوامل آزاد کننده دیگر را برای تازگی و غلظت چک کنید.
دومین علت مشکل:
خشک شدن خیلی سریع یا خیلی آهسته اتفاق می افتد.
راه حل:
– رطوبت را با رطوبت سنج چک کنید. اگر رطوبت خیلی بالاست (خشک شدن خیلی آهسته است)، اسلایدها را گرم کنید یا جریان هوا را در طی خشک شدن لام ها افزایش دهید. اگر رطوبت خیلی پائین است (خشک شدن خیلی سریع انجام می شود)، متانول را در فیکساتیو زیاد کنید.
– زمانی که می خوهید قطره را روی لام بندازید، از ارتفاع کم این کار را انجام دهید و لام را در طی خشک شدن، در یک جای مسطح قرار دهید و از گرم کردن، شعله دادن و یا فوت کردن اجتناب کنید.
– اسلاید ها را بالای آب داغ روی یک کاغذ توالت مرطوب، یا نزدیک یک رطوبت ساز خشک کنید. لام هایی که در حال خشک شدن هستند را با یک جعبه که خشک شدن را آهسته می کند بپوشانید. لام های سرد را امتحان کنید، اسید استیک را در فیکساتیو افزایش دهید (به عنوان مثال ۵:۲ متانول: اسید استیک به جای ۳:۱) با فیکساتیو یک شب در یخچال بماند، چندین بار با فیکس بشوئید.
سومین علت مشکل:
وجود توده های سلولی یا کروموزوم های خرد شده.
راه حل:
– بگذارید توده ها یا کروموزوم های خرد شده ته نشین شوند، سوسپانسیون سلولی را برداشته و در یک لوله تمیز بریزید و تکرار کنید. اسلاید های متنوعی طبق دستورالعمل هایی که در بالا توضیح داده شده تهیه کنید.
چهارمین علت مشکل:
محلول هایپوتونیک ناکافی است و یا غلط ساخته شده است.
راه حل:
– مرحله هاروست را با حجم های زیاد هایپوتونیک تکرار نمائید. سعی کنید اسلایدهای متنوعی را اگر امکان تکرار وجود ندارد، تهیه کنید. و یا نوع دیگر یا غلظت متفاوتی از هایپوتونیک را امتحان کنید.
پنجمین علت مشکل:
نوع سلول (مثلا برخی فیبروبلاست ها، کشت های کوریونیک ویلی و غیره) با محتوای سنگین سیتوپلاسمی است.
راه حل:
– سعی کنید در مرحله هاروست این موارد را تنظیم کنید: افزایش زمان و حجم هایپوتونیک، استفاده از چندین فیکساتیو و امتحان محلول های هایپوتونیک متفاوت.
-
مشکل چهارم: کروموزوم ها یکنواخت نیستند، اما در کیفیت داخل سلول یا در سطح اسلاید متنوع هستند.
علت مشکل:
خشک شدن اسلاید به طور یکنواخت نیست.
راه حل:
– از فوت کردن، پرتاب کردن قطره از فاصله بالا، شعله دادن اجتناب کنید.
– اطمینان داشته باشید لایه آب روی لام قرار خیلی نازک و یک دست باشد.
– در حین خشک شدن سطح اسلاید را با فیکساتیو بپوشانید.
– قبل از استفاده لام ها را با دقت تمیز کنید.
– سوسپانسیون سلولی را به مدت یک شب در یخچال قرار دهید
– لام گیری را با فیکساتیو تازه مجدد امتحان کنید.
-
مشکل پنجم: کروموزوم ها تخت، نامشخص و یا مبهم (کمرنگ) به نظر می رسند.
علت مشکل:
مشکل خشک شدن است یعنی یا خیلی سریع و یا خیلی آهسته خشک شده است.
راه حل:
– ابتدا رطوبت سنج را چک کنید و ببینید که آیا مشکلی وجود دارد یا خیر
– اسلایدهای متنوعی مثل بخش (سیتوپلاسم باقیمانده قابل مشاهده) داشتیم تهیه کنید.
-
مشکل ششم: کروموزوم ها به صورت ضخیم، سیاه، با هاله ای بر روی سطح ظاهر می شوند.
علت مشکل:
مشکل خشک شدن است که احتمالا خیلی سریع نمونه خشک شده است.
راه حل:
– رطوبت سنج را چک کنید، تهیه اسلاید را برای مشکل (سیتوپلاسم باقیمانده قابل مشاهده ) ببینید.
– کاغذ توالت خیس، بخار و رطوبت ساز را امتحان کنید.
-
مشکل هفتم: تکه هایی از کروموزوم که در هاروست، کشت های با مدت زمان طولانی، دیده می شوند.
علت مشکل:
به طور طبیعی در کشت های با رشد و تراکم زیاد دیده می شوند.
راه حل:
– احتمالا یک مشکل نیست، بیشتر روش های رنگ آمیزی، این ماده را بر نمی دارند. مطمئن باشید که رقیق کردن این سوسپانسیون های سلولی، کیفیت نواربندی را بهتر می کند!
-
مشکل هشتم: کروموزوم ها روی هم افتادگی خیلی زیادی دارند.
اولین علت مشکل:
فیکساتیو کافی نبوده است.
راه حل:
– به مدت یک شب در یخچال فیکس کنید، با فیکس یک یا دوبار بشوئید.
دومین علت مشکل:
به دلیل ناکافی بودن تکنیک های گسترش کروموزومی این مشکل بوجود می آید.
راه حل:
– بامقدار فراوان فیکس لام را بپوشانید و با فیکساتیو اضافی سوسپانسیون سلولی را رقیق کنید
– از پیپت با نوک بزرگ تر استفاده کنید.
– در طی خشک شدن لام را به جای سطح شیب دار، به صورت تخت قرار دهید، تا خشک شود(روی یک کاغذ توالت خیس خشک کنید).
سومین علت مشکل:
حجم ناکافی ، مدت زمان و یا نوع محلول هایپوتونیک و یا درجه حرارت غلط محلول هایپوتونیک.
راه حل:
– مدت زمانی که در برابر محلول هایپوتونیک قرار می گیرد و همینطور حجم محلول هایپوتونیک را افزایش دهید.
– محلول هایپوتونیک را تا ۳۸ درجه سانتی گراد گرم کنید.
چهارمین علت مشکل:
اثر اتیدیوم بروماید
راه حل:
– فیکسیشن و هایپوتونیک را تنظیم کنید و اثرات بد آن را با روش های تهیه اسلاید کاهش دهید.
پنجمین علت مشکل:
کشت های آلوده به سلول های خون، یا سلول ها یا اپیتلیال مرده مثل مایع آمنیوتیک.
راه حل:
– کشت ها را پیش از اینکه کلسمید اضافه کنید چندین بار با محیط بشوئید.
– سریع و آرام محلول رویی را خالی کنید، تا دبریس ها از بین بروند.
– سوسپانسیون سلولی را برای تهیه اسلاید رقیق کنید.
برای شرکت در دوره های کارورزی و کارآموزی سیتوژنتیک و کاریوتایپ خون
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.
بیشتر بخوانید: