✍ راهنمای حل مشکلات احتمالی در حین آزمایش

برای حل اشکالات کار از جدول مشکلات پرتاپ کردن در مرحله هاروست و تهیه لام یا  trobleshooting استفاده می کنیم.

 مشکلات، دلایل ممکن ایجاد مشکل، راه حل/ دستورالعمل:

مشکل اول: کروموزوم نداریم و یا کروموزوم خرد شده داریم.

 دلیل اول: سلول ها در مرحله هاروست شکسته شدند، بیمار فوت شده، یا در حال مرگ، و یا تحت بیهوشی است. سلول های سینکرونه شده: سلول های هاروست شده ای هستند با زمان آزاد سازی نادرست.

 راه حل/دستورالعمل: با زمان های آزاد سازی مختلف آزمایش کنیم. هاروست را با اضافه کردن آرام فیکساتیو یا هایپوتونیک، فیکساتیو سرد، کاهش حجم یا زمان هایپوتونیک تکرار کنید.

دلیل دوم: زمان تهیه اسلاید سلول های شکسته شده، کروموزوم هاشون پخش شدند.

راه حل: سعی کنید روش های تهیه اسلاید را تغییر دهید به این صورت: قطره را از فاصله پائین تر بیندازید و یا زاویه اسلاید را طی پرتاب و خشک شدن افزایش دهید،‌ غلظت متانول را در فیکساتیو افزایش دهید، یک شب در فیکساتیو سرد و در یخچال بگذارید، منتظر یک روز یا مدتی از روز، با بیشترین رطوبت باشید. سعی کنید اسلایدها را خشک کنید، جریان فیکس کمتر باشد، با پیپت  کوچکتری کار کنید، از پنجره و فن و باد کولر دور باشید، و در طی خشک شدن اسلایدها را گرم کنید.

مشکل دوم: کروموزوم های جمع و مچاله شده داریم که می تواند به دلایل مختلف رخ دهد:

دلیل اول: این مشکل، این است که مدت زیادی در برابر بازدارنده میتوتیک قرار گرفته و یا هایپوتونیک خیلی غلیظ، با غلظت اشتباه بکار رفته است.

راه حل/دستورالعمل: هاروست را تکرار کنید، دوره زمانی بازدارنده میتوتیک را قطع کنید. هاروست را با غلظت های مختلف هایپوتونیک، تکرار کنید.

دلیل دوم: کروموزومها های جمع و مچاله داریم این است که هایپوتونیک در حجم کم و ناکافی است.

راه حل/دستورالعمل: سعی کنید غلظت اسید استیک، فیکساتیو را افزایش دهید، غلظت سلول را در فیکساتیو رقیق کنید و اگر لازم است هاروست را تکرار کنید.

دلیل سوم: میتوژن (PHA) بیش از حد کافی است یعنی .(overdose)

راه حل/دستورالعمل: خون را دوباره کشت دهید، از میتوژن در غلظت های متفاوتی استفاده کنید.

دلیل چهارم: نمونه ای که از بیمار بدست آمده چند تا حالت ممکن است داشته باشد، یا بیمار در حال مرگ بوده، یا بیمار مرده، و یا بیمار تحت بیهوشی یا تحت درمان با فنوباربیتال (نوزادان)، و یا بیمار .ی که مریض، بیمار سوء تغذیه دارد، یا باردار است

دلیل پنجم: درجه انکوباتورخیلی بالا باشد(البته در مورد خون)

راه حل/دستورالعمل: سعی کنید پیش از انجام کشت لنفوسیت ها را جدا کنید و بشوئید.

درجه انکوباتور را که باید بین ۳۷-۳۶ درجه سانتی گراد باشد حتما چک کنید. و در درجه حرارت صحیح، دوباره کشت دهید و هاروست کنید.

مشکل سوم: متافازها درون سیتوپلاسم اند و سیتوپلاسم باقی مانده قابل مشاهده است.

دلیل اول: سلول های سینکرونیزه شده یعنی زمان آزاد سازی بلوک سلولی نادرست است و سلول ها تصادفی آزاد نشدن و فقط سلول های مقاوم به سینکرونی تقسیم شده اند.

راه حل/دستورالعمل: با زمان های آزاد سازی مختلف امتحان کنید، تایمیدین و عوامل آزاد کننده دیگر را برای تازگی و غلظت چک کنید.

دلیل دوم: دیگری که باعث می شود متافازها درون سیتوپلاسم باشند و سیتوپلاسم باقی مانده قابل مشاهده باشد، این است که  خشک شدن خیلی سریع یا خیلی آهسته اتفاق می افتد.

راه حل/دستورالعمل: رطوبت را با رطوبت سنج چک کنید. اگر رطوبت خیلی بالاست (خشک شدن خیلی آهسته است)، اسلایدها را گرم کنید یا جریان هوا را در طی خشک شدن لام ها افزایش دهید. اگر رطوبت خیلی پائین است (خشک شدن خیلی سریع انجام می شود)، متانول را در فیکساتیو زیاد کنید. زمانی که می خوهید قطره را روی لام بندازید، از ارتفاع کم این کار را انجام دهید و لام را در طی خشک شدن، در یک جای مسطح قرار دهید و از گرم کردن، شعله دادن و یا فوت کردن اجتناب کنید. اسلاید ها را بالای آب داغ روی یک کاغذ توالت مرطوب، یا نزدیک یک رطوبت ساز خشک کنید. لام هایی که در حال خشک شدن هستند را با یک جعبه که خشک شدن را آهسته می کند بپوشانید. لام های سرد را امتحان کنید، اسید استیک را در فیکساتیو افزایش دهید (به عنوان مثال ۵:۲ متانول: اسید استیک به جای ۳:۱) با فیکساتیو یک شب در یخچال بماند، چندین بار با فیکس بشوئید.

دلیل سوم: وجود توده های سلولی یا کروموزوم های خرد شده.

راه حل/دستورالعمل: بگذارید توده ها یا کروموزوم های خرد شده ته نشین شوند، سوسپانسیون سلولی را برداشته و در یک لوله تمیز بریزید و تکرار کنید. اسلاید های متنوعی طبق دستورالعمل هایی که در بالا توضیح داده شده تهیه کنید.

دلیل چهارم: محلول هایپوتونیک ناکافی است و یا غلط ساخته شده است.

راه حل/دستورالعمل: مرحله هاروست را با حجم های زیاد هایپوتونیک تکرار نمائید. سعی کنید اسلایدهای متنوعی را اگر امکان تکرار وجود ندارد، تهیه کنید. و یا نوع دیگر یا غلظت متفاوتی از هایپوتونیک را امتحان کنید.

دلیل پنجم: نوع سلول (مثلا برخی فیبروبلاست ها، کشت های کوریونیک ویلی و غیره) با محتوای سنگین سیتوپلاسمی است.

راه حل/دستورالعمل: سعی کنید در مرحله هاروست این موارد را تنظیم کنید: افزایش زمان و حجم هایپوتونیک، استفاده از چندین فیکساتیو و امتحان محلول های هایپوتونیک متفاوت.

مشکل چهارم: مشکل دیگری که در انجام آزمایش پیش می آید، این است که کروموزوم ها یکنواخت نیستند، اما در کیفیت داخل سلول یا در سطح اسلاید متنوع هستند.

دلیل: خشک شدن اسلاید بطور یکنواخت نیست.

راه حل/دستورالعمل: از فوت کردن، پرتاب کردن قطره از فاصله بالا، شعله دادن اجتناب کنید. اطمینان داشته باشید لایه آب روی لام قرار خیلی نازک و یکدست باشد. در حین خشک شدن سطح اسلاید را با فیکساتیو بپوشانید. قبل از استفاده لام ها را با دقت تمیز کنید، سوسپانسیون سلولی را به مدت یک شب در یخچال قرار دهید، و لام گیری را با فیکساتیو تازه مجدد امتحان کنید.

مشکل پنجم: این است که کروموزوم ها تخت، نامشخص و یا مبهم (کمرنگ) به نظر می رسند.

دلیل: مشکل خشک شدن است یعنی یا خیلی سریع و یا خیلی آهسته خشک شده است.

راه حل/دستورالعمل:ابتدا رطوبت سنج را چک کنید و ببینید که آیا مشکلی وجود داردیا نه، اسلایدهای متنوعی مثل بخش (سیتوپلاسم باقیمانده قابل مشاهده) داشتیم تهیه کنید.

مشکل ششم: کروموزوم ها ضخیم، سیاه، با هاله ای بر روی سطح ظاهر می شوند.

دلیل: مشکل خشک شدن است که احتمالا خیلی سریع نمونه خشک شده است.

راه حل/دستورالعمل: رطوبت سنج را چک کنید، تهیه اسلاید را برای مشکل (سیتوپلاسم باقیمانده قابل مشاهده ) ببینید. کاغذ توالت خیس، بخار و رطوبت ساز را امتحان کنید.

مشکل هفتم: تکه هایی از کروموزوم که در هاروست، کشت های با مدت زمان طولانی، دیده می شوند.

دلیل: بطور طبیعی در کشت های با رشد و تراکم زیاد دیده می شوند.

راه حل/دستورالعمل: احتمالا یک مشکل نیست، بیشتر روش های رنگ آمیزی، این ماده را بر نمی دارند. مطمئن باشید که رقیق کردن این سوسپانسیون های سلولی، کیفیت نواربندی را بهتر می کند.

مشکل هشتم: کروموزوم ها روی هم افتادگی خیلی زیادی دارند.

دلیل اول:  فیکساتیو کافی نبوده است.

راه حل/دستورالعمل: به مدت یک شب در یخچال فیکس کنید، با فیکس یک یا دوبار بشوئید.

دلیل دوم: به دلیل ناکافی بودن تکنیک های گسترش کروموزومی این مشکل بوجود می آید.

راه حل/دستورالعمل: بامقدار فراوان فیکس لام را بپوشانید، و با فیکساتیو اضافی سوسپانسیون سلولی را رقیق کنید و از پیپت با نوک بزرگ تر استفاده کنید. در طی خشک شدن لام را به جای شیب دار، بصورت تخت قرار دهید، تا خشک شود، روی یک کاغذ توالت خیس خشک کنید.

دلیل سوم:  حجم ناکافی ، مدت زمان و یا نوع محلول محلول هایپوتونیک و یا درجه حرارت غلط محلول هایپوتونیک.

راه حل/دستورالعمل: مدت زمانی که در برابر محلول هایپوتونیک قرار می گیرد و همینطور حجم محلول هایپوتونیک را افزایش دهید، محلول هایپوتونیک را  تا ۳۸ درجه سانتی گراد گرم کنید.

دلیل چهارم:  اثر اتیدیوم بروماید است.

 راه حل/دستورالعمل: فیکسیشن و هایپوتونیک را تنظیم کنید و اثرات بد آن را با روش های تهیه اسلاید کاهش دهید.

دلیل پنجم: کشت های آلوده به سلول های خون، یا سلول ها یا اپیتلیال مرده مثل مایع آمنیوتیک.

راه حل/دستورالعمل: کشت ها را پیش از اینکه کلسمید اضافه کنید چندین بار با محیط بشوئید، سریع و آرام محلول رویی را خالی کنید، تا دبریس ها از بین بروند، و سوسپانسیون سلولی را برای تهیه اسلاید رقیق کنید.

سیتوژنتیک – تکنیک  کاریوتایپ ( Karyotype technique )