✍ شناخت و بررسی محتوای mRNA

ترانسکریپتوم قسمت های پیچیده ای دارد که شامل صدها یا هزاران mRAN مختلف است که هر کدام بخشی از جمعیت کلی را می سازند. جهت تعیین ترانسکریپتوم لازم است که محتوای mRNA شناخته شود و همچنین فراوانی هر کدام مشخص شود.

مطالعه ترانسکریپتوم از طریق ریز آرایه ها یا آنالیز تراشه

روشی که می تواند مقایسه صحیح تری از مقدار هر mRNA در ترانسکریپتوم داشته باشد، در ابتدا به عنوان بخشی از پروژه پسا ژنومیک مخمر ایجاد شد. در اصل این روش ها نوع پیچیده ای از آنالیز های هیبریداسیون هستند. هر ژن مخمر(همه ۶۰۰۰ ژن آن) به شکل کلون های منفرد تهیه شدندو نمونه ها بر روی لام های شیشه ای در آرایش های ۸۰*۸۰ نقطه ای، نقطه گذاری شدند. این مجموعه را ریز آرایه می نامند. برای تعیین آنکه کدام ژن ها در سلول های رشد یافته مخمر تحت شرایط خاص فعال هستند، mRNA از سلول ها استخراج شده و به cDNA تبدیل می شود و cDNAهای نشانه دار شده و با ریز آرایه ها هیبرید می کنند. برای نشانه دار کردن از نشانه های فلورسانت استفاده می شود و هیبریداسیون به وسیله آزمایش ریزآرایه ها با میکروسکوپ هم کانون مشخص می شود. نقطه هایی که سیگنال می دهند نشان دهنده ژن هایی هستند که تحت شرایط مورد مطالعه فعال بوده اند. شدت سیگنال های هیبریداسیون نشان دهنده ی مقدار نسبی mRNA در ترانسکریپتوم است. تغییرات در بیان ژن که در هنگام انتقال سلول های مخمر به شرایط رشد متفاوت (مثل کمبود اکسیژن) ایجاد می شود، می توان از طریق تکرار آزمایش با cDNA دیگر کنترل نمود.

امروزه برای کنترل تغییرات ترانسکریپتوم بسیاری از جانداران ریز آرایه ها استفاده می شود. در بعضی نمونه ها روش کار با آن چیزی که برای مخمر استفاده می شود یکسان است. ریز آرایه ها نشان دهنده همه ی ژن های ژنوم است اما این حالت تنها برای جاندارانی که ژن های نسبتا کمی دارند امکان دارد . ریزآرایه ها برای کل ژن های انسان می تواند حداقل در ۱۰ لام ۱۸ میلی متر در ۱۸ میلی متر در نظر گرفته شود اما آماده سازی کلون تک تک ۲۰۰۰ تا ۳۰۰۰ ژن انسان کار بسیار سنگینی است. خوشبختانه این کار ضرورت ندارد زیرا در بسیاری از کاربردها فقط آن ژن هایی که در بافت مورد نظر خاص بیان می شوند مطلوب هستند. برای مثال برای مطالعه تغییرات ترانسکریپتوم ناشی از سرطان ریز آرایه ها با کتابخانه cDNA بافت طبیعی تهیه می شود. لذا هیبریداسیون باcDNA نشان دار از بافت سرطانی، آشکار خواهد کرد آیا ژن ها در پاسخ به حالت سرطانی تنظیم افزایشی یا کاهشی نشان داده اند.
یک جایگزین برای ریز آرایه ها به وسیله تراشه های DNA فراهم شده است که صفحات نازکی از سیلیکون ها سنتز می شوند و می توانند در تراکم یک میلیون در هر سانتی متر مربع تهیه شوند، که بسیار بیشتر از تراکم ممکن در ریزآرایه سنتی است. هیبریداسیون بین اولیگونوکلئوتید و جستجوگر به طور الکترونیکی تشخیص داده می شود. به علت سنتز شدنde novo اولیگونوکلئوتیدها، با استفاده از روش های خودکار، تراشه ای با ۲۰۰۰۰ تا ۳۰۰۰۰ الیگونوکلئوتید که هر اولیگونوکلئوتید اختصاصی یک ژن متفاوت از انسان است، نسبتا راحت تهیه می شود.

مطالعه ترانسکریپتوم از طریق  SAGE

راه مستقیم و هدایت شده جهت شناخت ترانسکریپتوم تبدیل mRNA بهcDNA و سپس توالی یابی cDNA می باشد. یک احتمال توالی یابی قطعات وارد شده هر کلون در یک کتابخانه یcDNA می باشد. مقایسه بین توالیcDNA و توالی ژنوم، مشخصات ژن هایی که mRNA آن ها در ترانسکریپتوم حضور دارند، آشکار خواهد کرد. این روش گرچه امکان پذیر اما بسیار دشوار است، به این دلیل که تعداد توالی های cDNAبسیار زیادی قبل از اینکه تصویر تقریبا کاملی از ترکیب ساختار ترانسکریپتوم آشکار شود، مورد نیاز است.
آنالیز پشت سر هم بیان ژن (SAGE)یک راه حل ممکن را برای تشخیص سریع mRNAها در ترانسکریپتوم فراهم می کند. SAGEشامل توالی های کوتاه به اندازه bp12 هست که هر کدام از آن ها نماینده یک mRNA در ترانسکریپتوم می باشند. این توالی ها علیرغم اینکه کوچک هستند اما توانایی کافی برای شناسایی ژن های کد کننده این mRNA را دارند. این توالی های کوتاه اساس این روش می باشند.
اولین گام در تولید توالی های ۱۲pb جمع آوری mRNA در ستون کروماتوگرافی بر اساس جفت شدن دنباله پلی A در انتهای ۳` این مولکول ها با رشته پلی T وصل شده به دانه های سلولزی در ستون می باشد .

mRNA به مولکول دو رشته ای cDNA تبدیل شده و سپس توسط آنزیم های اندونوکلئاز محدودالاثر با توالی شناسایی ۴ نوکلئوتیدی مثل AluI تیمار می شود. در نتیجه هر cDNA بریده خواهد  شد. آخرین قطعات محدود cDNA به دانه های سلولزی متصل می ماند و سایر قطعات از ستون شسته شده و خارج می . سپس یک اتصال دهنده کوتاه به انتهای آزاد هر مولکول cDNA وصل می شود که این اتصال-دهنده یک توالی شناسایی برای آنزیم BsmFI دارد. این آنزیم غیر معمولی است که به جای آنکه توالی شناسایی خود را برش بزند، حدود ۱۰ تا ۱۴ نوکلوتید پایین دست آن را برش می زند. تیمار با این آنزیم قطعات با حدود ۱۲bp را از انتهای هر cDNA حذف می کند.
این قطعات جمع آوری شده و از طریق سر به دم به یکدیگر وصل می شوند و یک زنجیره را می سازند. این زنجیره تعیین توالی می شود. در روش اولیه زنجیره ها کلون می شدند و سپس به کمک روش خاتمه زنجیره توالی یابی می شدند، اما آن ها به کمک روش توالی یابی نسل بعد هم می توانند تعیین توالی شوند. هر توالی را می توان جداگانه شناسایی نمود زیرا آن ها از محل BsmFI جدا می شوند. مطالعه ترانسکریپتوم از طریق RNA-seq تکنیک ها ی توالی یابی نسل بعد که در اواخر دهه ۲۰۰۰ ایجاد شدند، علاوه بر DNA می توانند به راحتی برای RNA هم بکار روند. تمام آنچه مورد نیاز است تبدیل RNA به cDNA قبل از آماده سازی برای توالی یابی کتابخانه است. برای مثال برای بدست آوردن توالی یک mRNA در یک ترانسکریپتوم، RNA استخراج شده با مهره های مغناطیسی که توسط الیگو dT پوشیده شده اند مخلوط می شوند تا mRNA ها از طریق دم پلی A با آن ها هیبرید شوند. سپس در یک بافر حاوی منیزیوم یا سایر کاتیون-های دو ظرفیتی غوطه ور می¬شوند و پس از آن تا دمای ۹۴ درجه سانتیگراد برای چند دقیقه حرارت داده می شوند.

این عملیات در نهایت منجر به شکسته شدن mRNA و تولید قطعات کوچک مناسبی برای توالی یابی نسل بعد می شود. وقتی که cDNA دو رشته ای ایجاد شد، می توان آماده سازی کتابخانه برای توالی یابی DNA را در پیش گرفت.
توالی یابی نسل بعد RNA اصطلاحا RNA-seq خوانده می شود. همانند توالی یابی DNA ،میلیون ها توالی منفرد RNA بدست می آید. این بدان معنی است که هر mRAN در ترانسکریپتوم به دفعات توالی یابی می شود، بنابراین حتی mRNA های بسیار نادر در بافت های خاص هم قابل شناسایی هستند. همان طور که تعداد خوانش های هر mRNA متناسب با فراوانی نسبی آن mRNA در ترانسکریپتوم می باشد، روشRNA-seq فراهم کننده ی هم اطلاعات کمی هم کیفی در مورد ترانسکریپتوم می باشد. نسخه های تغییر یافته ی تخلیص های ابتدایی می توانند روش RNA-seq را به سمت شناسایی سایر انواع RNA ها از جمله miRNA ها هدایت کند.

مبحث مطالعه ژنوم

مطالعه ژنوم – پروتئوم(Proteome)

مطالعه ژنوم – ترانسکریپتوم(Transcriptome)