روش کار/پروتکل استخراج RNA با ترایزول(®TRIzol)
استخراج RNA یکی از حساس ترین ماکرومولکول های حیات، مقدمه ی بسیاری از پژوهش های مولکولی مهم است. طی این فرآیند سلول و یا بافت تخریب شده و ترکیبات داخلی آن خارج می شود سپس مولکول RNA از مولکول های DNA و پروتئین جدا می شود و خالص می شود. آنزیم RNAse قادر به تخریب RNA موجود در محیط است که توسط تمام موجودات تولید و به محیط وارد می شود و حضور آن در محیط فرآیند استخراج RNA را با مشکل مواجه می کند.
امروزه یکی از موثرترین روش های استخراج RNA از نمونه های بیولوژیک استفاده از معرف گوانیدینیوم تیوسیانات-فنل است که در دنیا با نام های تجاری TRIzol، TRI reagent، QIAzol و … عرضه می شود. در این مقاله آموزشی به نحوه استفاده از معرف های نامبرده جهت استخراج RNA خواهیم داشت.
برای دریافت خدمات استخراج RNA
از طریق لینک خدمات آزمایشگاهی می توانید اقدام نمایید
نکات Pro-Tip که قبل از انجام آزمایش بهتر است در نظر گرفته شود:
RNA ها به اندازه DNA پایدار نیستند و به شدت مستعد تخریب بواسطه حرارت، RNaseها و سایر آنزیم ها هستند بنابراین همیشه از دستکش استفاده نمایید و تا جایی که ممکن است نمونه های RNA و معرف ها را سرد نگه دارید.
محیط انجام کار، تجهیزات و معرف ها را بدون RNase نگه دارید. در برخی موارد ممکن است نیاز به استفاده از محلول های ضدعفونی کننده RNase مانند ®RNaseZap یا ®RNase AWAY باشد.
در فرآیند استخراج RNA از مواد سمی و خطرناکی استفاده می شود که می توانند منجر به آسیب جدی به اپراتور شوند از اینرو توصیه می شود حتما از ماسک و دستکش لاتکس استفاده شود.
مراحل استخراج RNA با ترایزول(استخراج RNA با روش دستی/بدون استفاده از کیت)
نخستین قدم برای شروع آزمایش، آماده سازی نمونه است. استخراج از خون و سلول می تواند خیلی سخت گیرانه نباشد اما چنانچه از بافت استخراج می کنید، برای هموژن کردن، بافت را با استفاده از ازت مایع؛ داخل یک ظرف (ترجیحا هاون چینی) بکوبید یا بافت را توسط سونیکاتور و یا هموژنایزر خرد کنید.
در مرحله دوم تمام محتوی نوکلئیک اسیدی را در محلول TRIzol لیز کرده و سانتریفیوژ نمایید. به سرعت و دقت عمل توجه داشته باشید؛ تا RNAی شما در دمای محیط تخریب نشود.
ترایزول محلولی اسیدی که شامل مخلوط فنول برای از بین بردن پروتئین ها و گوانیدینیوم تیوسیانات برای کاهش سرعت تخریب RNA است. توجه داشته باشید پس از اضافه کردن ترایزول به نمونه ها، هر چند دقیقه یکبار( هر بار به مدت 10 ثانیه) ورتکس انجام دهید.
در صورتی که استخراج از سلول انجام می شود به ازای هر یک میلیون سلول(محتوی یک فلاسک) به میزان 250-200 لاندا ترایزول استفاده نمایید اما برای نمونه های بافت(به اندازه دانه عدس) نیاز به 1 میلی لیتر ترایزول می باشد. به طور معمول حجم ترایزول 10 برابر حجم نمونه های بافت و سلول است به جز نمونه های خون.
چنانچه استخراج از خون انجام می شود مقداری خون را در تیوب ریخته و دو برابر حجم خون آب مقطر سرد به آن اضافه نمائید. به منظور لیز گلبول های قرمز چندین مرتبه به شدت تکان(shake) و به صورت متناوب با قرار دادن میکروتیوب بر روی یخ و قرار دادن در دمای اتاق، شوک حرارتی به نمونه دهید.
مدت زمان در معرض ترایزول قرار گرفتن نمونه های خون،سلول و بافت های عادی حدود 5 الی 10 دقیقه می باشد در حالیکه در مورد بافت های مقاوم همانند استخوان، این مدت زمان تا 60 دقیقه می تواند افزایش پیدا کند.
– افزایش گرانروی خون در نمونه نشانگر لیز شدن گلبولهای قرمز است.
– میکروتیوب را در دمای ترجیحا 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ کنید.
– این مرحله را تا زمان شیری رنگ شدن رسوب (pellet) و عدم مشاهده رنگ قرمز تکرار نمائید.
گام سوم تخلیص است که با استفاده از کلروفرم و ایزوپروپانول انجام می شود. توجه داشته باشید پس از اضافه کردن کلروفرم، استفاده از ورتکس ممنوع است و فقط می توانیم شیک کنیم.
کلروفورم سرد به میکروتیوب اضافه کرده و به مدت 30 ثانیه به شدت تکان دهید. 10 الی 15 دقیقه میکروتیوب را در دمای اتاق قرار دهید و سپس میکروتیوب حاوی نمونه را در 14000 rpm در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ نمائید. در پایان این مرحله سه فاز مشخص می شود.
نقش کلروفرم در استخراج RNA چیست؟ کلروفرم باعث بوجود آمدن 3 فاز آبی، اینترفاز و ارگانیک می شود که فاز آبی غالبا حاوی نوکلئیک اسیدها و مقادیری از سایر ماکرومولکول ها می باشد. اینترفاز غالبا حاوی DNA و مفادیری پروتئین و فاز ارگانیک حاوی مواد غیرمحلول است که به رنگ قرمز-صورتی خواهد بود. مراقب باشید که لایه اینترفاز را با نوک پیپت خود به هم نزنید.
با دقت فاز آبی رویی را به میکروتیوب جدید RNase free سرد منتقل نموده و بر روی آن به میزان هم حجم(نسبت برابر)، ایزوپروپانول سرد(و یا دو برابر حجم، اتانول مطلق) بریزید. چندین بار میکروتیوب را سر و ته(اینورت) کرده و به مدت حداقل 20 دقیقه در فریزر 20 – درجه سانتیگراد قرار دهید.
در این مرحله می توان برای مدت زمان طولانی تری RNA را در فریزر قرار داد. این امر خود موجب افزایش راندمان استخراج RNA خواهد شد. سپس میکروتیوب را به مدت 20 دقیقه با دور 140000 rpm در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ نمائید.
در مرحله چهارم فرآیند شستشو را انجام می دهیم. در این مرحله سوپرناتانت را تخلیه کرده و بر روی رسوب 1 میلی لیتر اتانول 70% اضافه کنید. چند مرتبه پیپتاژ کرده و سپس 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با دور 10000 rpm سانتریفیوژ نموده تا RNA رسوب کند. حداقل 2 بار مراحل شستشو را تکرار نمایید.
مرحله آخر حل کردن رسوب RNA با آب DEPC است که می تواند ضریب تخریب RNA را تا 98% کاهش دهد.
بسته به میزان RNA استخراج شده، 20 الی 50 میکرولیتر DEPC treated water اضافه کرده و با پیپتاژ کردن رسوب RNA را حل نمائید. نگهداری RNA در DEPC در دمای 20 – می تواند باعث حفظ سلامت نمونه تا 10 روز شود و در صورت نگهداری در دمای 70 – این مدت تا یکسال افزایش پیدا می کند.
پس از اتمام فرآیند استخراج، جهت ارزیابی کیفی سلامت RNA استخراج شده(integrity)، الکتروفورز AGE انجام می دهیم که مطمئن شویم RNA خرد نشده باشد. به دلیل وجود بیان در ژن های rRNA، از دو مارکر 28srRNA(برای قطعات بلند) و 18srRNA(برای قطعات کوچک تر) استفاده می کنیم که نتایج همانند شکل زیر می باشد.
همچنین برای ارزیابی کمی مقدار(Gravitity)و خلوص(Purity) با نانودراپ اسپکتوفتومتری انجام می دهیم.
در صورت تایید کیفیت RNA استخراج شده می توان از آن یرای سنتز cDNA استفاده نمود.
بیشتر بخوانید: