✍ کاربرد تکنیک کشت سلول اولیه یا primary culture در آزمایشگاه های سلولی

یکی از مهمترین آلودگی های آزمایشگاه کشت سلول آلودگی مایکوپلاسمی است. توجه و داشتن آمادگی ذهنی برای مقابله با این آلودگی آنقدر مهم است که  قبل از شروع تکنیک های مربوط به کشت سلول، باید درمورد تکنیک های آسپتیک بدانید.

روش/تکنیک کشت اولیه یا primary culture

جداسازی سلول موردنظر (سلولی که می خواهیم کشت بدهیم) از بافت و آماده سازی کشت اولیه، اولین و شاید حیاتی ترین مرحله برای کشت سلول ها با عملکرد های خاص است .اگر سلول های مورد نیازمان در این مرحله از بین بروند، ضرر و زیانی که دیدیم قابل جبران نیست.

کشت اولیه ی سلول به مرحله ای گفته می شود که سلول ها را از بافت مورد نظر جدا کردیم و این سلول ها در یک شرایط مناسب تکثیر می شوند تا زمانی که سطح پلیت را بطور کامل اشغال کنند (اگر سلول ها از نوع چسبنده بوده و رشدشان بصورت سوسپانسیون نباشد). پس از جدا شدن از بافت این خیلی مهم است که سلول ها منفرد یا به اصطلاح single شوند. بعد از آن سلول ها را در پلیت یا ظروف چند خانه ای که به اصطلاح به هرکدام از خانه ها well می گویند قرار می دهیم. محیط کشت مناسب که معمولا حاوی سرم گاوی (FBS) است را اضافه می کنیم. قطعا این محیط کشت حاوی هورمون ها و آنزیم ها و مواد مغذی ویژه ی هر سل لاین نیز است. سپس پلیت ها را داخل انکوباتور قرار می دهیم که سلول ها روند رشد و تکثیر خودشان را شروع کنند. همانطور که می دانید انکوباتور عمل حفظ دمای طبیعی و ثابت بدن را انجام می دهد و بعضی از انکوباتورها فشار گاز های CO2 و O2 را نیز تنظیم می کنند. بسته به نوع سل لاینی که کار می کنیم، مدت زمان فاز تاخیری، فاز رشد و توقف سلول ها باهم متفاوت است. اما به هرحال سلول ها نیازمند دفع مواد زائد و استفاده ی کافی از مواد مغذی هستند و بعد از مدتی که میزانشان از یک حدی بیشتر شود در این موارد دچار مشکل می شوند. تا رسیدن به این مرحله معمولا در روز ۳ و ۶، ما باید محیط کشت قبلی را کامل خارج کنیم و محیط جدید را وارد پلیت سلول ها کنیم. پس از پوشیده شدن صفحه ی پلیت نیاز است که سلول ها را از یک پلیت به دو پلیت تقسیم کنیم‌. روال کار با اکثر سلول ها همین نسبت ۱ به ۲ است اما گاهی پیش می آید که این نسبت ۱ به ۴ هم شود. پس اگر دارید در ادامه ی کار نفر قبلی که کشت سلول اولیه را  انجام داده کار می کنید حتما این نسبت را از آن فرد بپرسید تا در محاسباتتون دچار مشکل نشوید.

دستورالعمل جدا کردن سلول ها از کف پلیت و انتقال آنها

۱-محیط کشت سلول ها را خالی می کنیم و آن ها را با حجم کمی PBS شستشو می دهیم.

۲-سپس PBS را خالی می کنیم و برای جداشدن سلول ها از کف پلیت یا فلاسک آنزیم تریپسین به همراه EDTA در حدی که کف را کاملا بپوشاند اضافه می کنیم و برای ۲-۵ دقیقه می گذاریم در انکوباتور که انکوبه شود.

۳-بعد از آن با مشاهده ی ظرف زیر میکروسکوپ، مطمئن می شویم که سلول ها از کف جداشدن و حالا محیط کشت حاویFBS را به سلول ها اضافه می کنیم تا اثر تریپسین را خنثی کنیم.

۴-بعد از چند بار پیپتاژ سلول های جدا شده را داخل یک فالکون می ریزیم و داخل سانتریفیوژ قرار می دهیم.

۵-محیط روی لوله ها را تخلیه کرده و محیط جدید به آن اضافه می کنیم.

پیش از پاساژ دادن سلول ها معمولا لازم است که با استفاده از رنگ تریپان بلو و شمارش سلول های رنگی، میزان زنده مانی سلول ها را بسنجیم.

پروتکل های زیادی برای یک تکنیک واحد وجود دارد که شما باتوجه به نوع سلولی که کار می کنید وحتی شرایط و تجربه ی افرادی که در آزمایشگاه محل فعالیت شما کار می کنند می توانید از یکی از این پروتوکل ها استفاده کنید. میزان آنزیم و هورمون افزوده و استفاده از محیط های مغذی، همه بستگی به نوع کار شما دارد. مشورت با افراد با سابقه را جدی بگیرید که گاهی از اجرای پروتوکل ها نیز بیشتر به شما کمک می کند.