✍ آزمایش استخراج/تخلیص DNA

 پایه تمام تحقیقات ژنتیک مولکولی، بررسی و آنالیز DNA است. بنابراین اولین گام، قبل از تکنیک های مولکولی مختلف مثل PCR  روش هایی برای استخراج و تخلیص DNA است که اولین بار توسط فردریش میشر در سال ۱۸۶۹ انجام گرفت. استخراج DNA  از نمونه های مختلف اعم از مایعات مختلف بدن (خون، بزاق و …)، بافت های زنده و فیکس شده، سلول ها، باکتری ها و … می باشد، که با وجود پروتکل های متنوعی که برای هر کدام وجود دارد، وجه اشتراک همه ی آن ها جدا کردن DNA از سایر اجزای سلولی می باشد .

مراحل مشترک در استخراج DNA  از نمونه های مختلف:

۱ ) از بین بردن غشای سلولی یا لیز کردن سلول ها:

در این مرحله از روش های فیزیکی و شیمیایی برای لیز سلول استفاده می شود. عمدتا  بافر های لیز کننده حاوی دترجنت های یونی و غیر یونی  هم چون SDS ,Triton X100,NP-40   و… به منظور لیز سلول و کمک به از بین بردن پروتئین های غشاء و پروتئين هاي متصل  به DNA و هم چنین موادی مانند Tris-HCl و EDTA به منظور تنظیم اسیدیته و اسمولاریته لازم برای لیز، می باشند

۲) جداکردن DNA  از سایر اجزای سلولی و خالص سازی DNA:

در این مرحله از موادی هم چون فنل و کلروفرم که با ایجاد شیب چگالی باعث ایجاد چندین فاز آبی، پروتئین ها و فاز آلی می شود و و یا نک های اشباع که باعث کلاته شدن و در نهایت پس از سانتریفیوژ باعث رسوب پروتیئن خواهند شد می توان استفاده کرد ولی در صورتی که مقدار پروتئین عصاره سلولی بسیار بالا باشد بهتر است از آنزیم های تجزیه کننده پروتئین ها (پروتئیناز K )  و هم چنین به طور اختیاری جهت از بین بردن RNA به طور کامل می توان از RNase  استفاده کرد.

۳) تغلیظ DNA :

تغلیظ به معنای بالا بردن غلظت DNA در حجم محلول است که برای این کار از اتانول ۹۶% و ایزوپروپانل سرد استفاده می شود در این مرحله کلاف DNA مشاهده می شود.

۴) شست و شو:

در این مرحله از اتانول ۷۰% برای جداسازی نمک ها از رسوب  DNA استفاده می شود ولی باید مدتی بماند که اتانول کاملا از رسوب حذف شود چون مهار کننده ی PCR می باشد و در نهایت رسوب در آب مقطر دو بار تقطیر و یا TE حل می شود.

استخراج DNA از خون به روش رسوب دهی نمک (Salting out)