✍ کاربردهای تکنیک Nested PCR 

گاهی در PCR عادی پرایمر ها به طور نادرست بهDNA  هدف متصل شده و قطعات غیراختصاصی نسبت به پرایمر تکثیرمی شود و هر چقدرهم تعداد سیکل های PCR و مدت زمان Extension ثانویه بیشتر باشد احتمال اتصال نادرست افزایش می یابد، در چنین شرایطی اگر طراحی پرایمر بهتری که به درستی به توالی هدف متصل شود برای ما میسر نباشد برای افزایش حساسیت و اختصاصیت واکنش می توان از Nested PCR  استفاده کرد. حتی در مواقعی که کیفیت DNA  ما مناسب نیست و مقدار آن در نمونه بسیار کم است، استفاده ازاین تکنیک می تواند باعث افزایش تولید محصول هدف تا چندین برابر محصول تولید شده در PCR معمولی شود.

در سال ۱۹۸۸ این تکنیک توسط Rechitsky وStorm  مطرح گردید و به خاطر نحوه ی قرار گرفتن پرایمر های مورد استفاده در واکنش اول و دوم نسبت به هم Nested (تودرتو) نامگذاری شد. این تکنیک در واقع دارای ۲ فرایند PCR متوالی است که هر کدام از ۳۰ سیکل تشکیل شده درPCR  اول از یک جفت پرایمر خارجی Outer Primers  که در خارج از توالی هدف متصل می شوند استفاده می شود و درنهایت قطعات بزرگتری نسبت به توالی موردنظرمان تکثیر می شود. در واکنش PCR  دوم از یک جفت پرایمر Nested   یا به عبارتی Inner Primers پرایمرهای داخلی استفاده می شود، که در محلی میان دو پرایمر مورد استفاده درواکنش PCR اول به توالی موردنظرمان اتصال پیدا می کند و در نتیجه قطعات کوتاه تری نسبت به محصولات PCR  اول ایجاد می شود . در صورتی که پرایمرهای داخلی ما در واکنش PCR  دوم منجر به تولید محصول شود، تأکیدی بر صحت واکنش اول و اختصاصی بودن محصول حاصل از آن می باشد .

یک مرحله انتقال هم بین دو مرحله ی اول و دوم PCR  وجود دارد که محصولات حاصل از واکنش PCR اول به تیوب واکنش PCR  دوم منتقل می شود البته برای نتیجه بهتر لازم است که مقدار پرایمرهای داخلی بیشتر از پرایمر خارجی باشد . از معایب این تکنیک می توان به این موضوع اشاره کرد که در مرحله انتقال و استفاده از دو تیوب مجزا احتمال  آلودگی محیط  آزمایشگاه با محصول PCR  افزایش می یابد .

Nested PCR  انواع دیگری نیز دارد:

Semi_nested PCR: در این روش درواکنش PCRاول از دو پرایمر خارجی و در واکنشPCR  دوم از یک پرایمرداخلی و یکی از پرایمر های خارجی مورد استفاده در واکنش اول استفاده می شود و در نهایت  اختصاصیت تقویت می شود.

Pit_stop PCR : این تکنیک هم دقت و اختصاصیت Nested PCR  و هم سرعت PCR  معمولی را دارد از این رو بهبود یافته و مؤثرتراست. در این تکنیک تعداد سیکل های واکنش PCR  اول را تا حدود ۱۰ سیکل کاهش می دهند و مقدار بسیار کمی از آن را به عنوان نمونه برای واکنش PCR دوم که تعداد سیکل های آن بیش از ۲۰ سیکل هست استفاده می کنند.هم چنین در این روش مانند Nested PCR  از جفت پرایمر جدیدی به عنوان پرایمر داخلی استفاده می شود.