✍ دستورالعمل و مراحل کشت نمونه خون محیطی

مراحل انجام آزمایش کاریوتایپ خون:

۱- کشت نمونه خون محیطی

۲- هاروست

۳- لام گیری

۴- G بندینگ

کشت نمونه خون محیطی: اولین مرحله کشت سلول محسوب می شود با هدف افزایش تعداد سلول های نمونه، که برای این منظور به مواد میتوژن نیاز داریم. میتوژن ها موادی هستند که سلول راتحریک به تقسیم می کنند. خود این مرحله (کشت نمونه خون محیطی)، شامل چند بخش می شود.

پذیرش و آماده کردن نمونه: فراوانترین نمونه بافتی در تعداد زیادی از موارد بالینی، برای تشخیص های سیتوژنتیکی، نمونه خون محیطی است. خون محیطی از بیماران در تمامی سنین به راحتی گرفته می شود. روش کار به این شکل است که، نمونه خون محیطی با یک سرنگ هپارینه ۵-۲ ml از بیمار گرفته می شود. برای اینکه سلول های خون میتوز های متوالی انجام دهند، باید تحریک شوند. که این تحریک بوسیله فاکتورهای پروتئینی و ویروسی، بعضی از lectin ها استفاده می کنند که به آن ها mitogens می گویند. مانند:

Phytohemagglutinin(PHA) , Pokeweed  mitogen, Concanavalin A, Epstein_Barr Viruse(EBV) ، فقط T-cell ها را تحریک می کند و بر روی B-cell ها اثر کمی دارد یا اثری ندارد.EBV اختصاصا B-cell ها را تحریک می کند (B-cell ها لنفوسیت هایی از سیستم ایمنی بدن هستند که در مقابل پاتوژن هایی مثل ویروس پادتن تولید می کنند. این لنفوسیت ها در ایمنی همورال نقش دارند، که همراه با ایمنی سلولی مکانیسم دفاع اختصاصی تشکیل می دهند).

میتوژن Concanavalin A,  pokeweed,  و EBV  گاهی اوقات به تنهایی و یا باهم برای تحریک B لنفوسیت ها، در نمونه هایی که از بیماران لوسمی بدست آمده بخصوص CCL ها بکار می روند. نکته مهم که باید به آن توجه کنیم این است که، نمونه خون محیطی نباید لخته شده باشد و برای جلوگیری از لخته شدن خون از هپارین به عنوان ضد انعقاد، در موقع خونگیری استفاده می شود.

نوع و نحوه نگهداری نمونه های بیمار

نمونه خون را در سدیم هپارین یا لیتیوم هپارین (لوله با درب سبز) جمع آوری و در درجه حرارت اتاق نگهداری می شود.

نمونه های غیر قابل قبول شامل: نمونه های جمع آوری شدن در ماده ضد انعقاد اشتباه مثلا EDTA ، نمونه هائ که بیشتر از ۷۲ ساعت مانده باشند، نمونه های کمتر از ۱mlیا نمونه هایئ که در معرض حرارت قرار گرفته باشند.

• خون هرگز نباید یخ بزند و یک هفته می توان در قسمت پایئن یخچال نگهداری  نمود.
• اگر خون با ماده ضد انعقاد EDTA گرفته شود با سرم فیزیولوژی یا محیط بدون سرم ۳ بار شستشو داده می شود و سپس با اضافه کردن هپارین کشت دهید.

دستورالعمل/کشت خون-نمونه لازم

در این مرحله برای بزرگسالان ۷ قطره خون بدون سر سوزن ۰/۴cc، بچه های کوچک ۰/۳cc، نوزادان و جنین۰/۲cc ، زنان باردار و تازه فارغ شده۰/۵cc ، برای ۵ ml محیط کامل استفاده می شود می گردد.

اساس کشت خون محیطی که با PHA تحریک شده

فیتوهماگلوتینین که از لوبیای قرمز استخراج می شود موجب تقسیم گلبول های سفید خون می شود. ماکزیمم زمانی که سلول ها به اندیکس میتوزی می رسند ۶۸ تا ۷۲ است. اضافه کردن کلسمید سلول ها را در مرحله متافاز نگه می دارد سپس سلول ها با استفاده از هایپوتونیک و فیکساتیو هاروست می شوند و در این مرحله است که کروموزوم ها قابل شناسایی هستند.

پروتکل/دستورالعمل کشت خون محیطی

آماده کردن محیط کشت

• محیط کشت( McCoy 5 A  یاRPMI 1640  یا Ham’s F10 )                                           ۸۰۰cc
• سرم (FBS یا BS )                                                                                                   ۲۰cc
• پنی سیلین/ استرپتومایسین (ml/ 10mg and ml / 10,000u)                                            ۱cc
• فیتوهماگلوتینین (PHA)                                                                                            ۲cc
• ال_ گلوتامین (ml / 2 mg or 200 mM)                                                                        ۱cc

PH  نهایئ محیط کشت بایستی کمی قلیایئ یعنی بین ۷.۴ – ۷.۶  باشد.

می توان به این محیط کشت، ۱ml ، (optimal) 2-  mercaptoethanolاضافه کرد و این محیط را در لوله استریل۵ ml

تقسیم کنید و آنها را در منفی ۲۰ درجه سانتیگراد فریز نمائید. تقسیم محیط کشت در زیر هود و در کنار شعله و یا در هود laminar در شرایط استریل انجام می شود.

تذکر: پروتکل بر اساس setup هرآزمایشگاه متفاوت است.

دستورالعمل/روش کشت خون

۱-به هر لوله استریل، شامل ml 5 محیط کشت، مقدار مناسب خون را اضافه کنید و برای هر بیمار دو لوله متفاوت از نظر محیط کشت پایه به کار ببرید.

۲-به آرامی محتویات هر لوله کشت را مخلوط کنید. کشت ها را به مدت ۷۲ ساعت (۳روز ) در حرارت ۳۷ درجه سانتیگراد، در یک حالت مایل، در اتو انکوبه کنید.

۳- پس از سه روز( ۶۸ تا ۷۲ ساعت پس از شروع کشت) هاروست نمائید.

۴- دربعضی اوقات، مثل مواردی که لنفوسیت ها فعال هستند، به عنوان مثال نوزادان، می شود بعد از دو روز کشت را هاروست نمود (معمولا PHA به کار نمی رود.

در مواردی که چرخه سلولی کند است، مثل بیماران مبتلا به کم خونی فانکونی، می توان کشت را ۴ روزه هاروست نمود.

سیتوژنتیک – تکنیک کاریوتایپ- پروتکل/کشت نمونه خون محیطی

سیتوژ نتیک – تکنیک کاریوتایپ – پروتکل/هاروست (برداشت)

سیتوژنتیک – تکنیک کاریوتایپ پروتکل(مرحله لام گیری)

سیتوژنتیک – تکنیک کاریوتایپ – پروتکل/ رنگ آمیزی نواربندی (G-banding)