جمع آوری نمونه در کشت نمونه مغز استخوان
جمع آوری نمونه های مغز استخوان مشابه خون محیطی است. به این ترتیب که آسپیره های مغز استخوان باید در سرنگ یا لوله خلاء استریل که حاوی هپارین سدیم بدون نگهدارنده است، جمع آوری و در دمای اتاق منتقل شوند.
بهترین نمونه برای آزمایشگاه سیتوژنتیک چه نمونه ای است؟
چند میلی لیتر اول نمونه حاوی بیشترین میزان سلول است، پس بنابراین بهترین نمونه برای آزمایشگاه سیتوژنتیک محسوب می شود. در قسمت پایانی نمونه مغز استخوان را رقیق می کنند بنابراین تعداد سلول های فعال و تقسیم شونده کاهش پیدا می کند.
موفقیت کشت مغز استخوان به سلول های فعال و در حال تقسیم نمونه بستگی دارد . نمونه بعد از دریافت بدون تا̋خیر باید بررسی شده تا از مرگ سلولی جلوگیری شود.
انواع محیط های مورد استفاده برای کشت مغز استخوان
محیط های کشت پایه (Basal media) مورد استفاده برای مغز استخوان:
TC 199, Ham s F10, Eagle s MEM: McCoy s 5A Iscove s, RPMI 1640 هستند که:
McCoy s 5A , RPMI 1640، محیط های بهتری هستند. ظروف کشت بهتر است سطح وسیعتری داشته باشند. به دلیل اینکه سلولهای مغز استخوان با رشد سریع باید در معرض مواد غذایی بیشتری قرار بگیرند، پس باید از فلاسک کشت 25 سانتی متر مربع ، لوله لیتون و یا ظروف یونیورسال استفاده نموده و لوله لیتون بسیار مناسب می باشد.
دستورالعمل های/روش های کشت مغز استخوان
شامل ۲ روش است:
۱-روش کشت معمولی
۲- روش کشت با قدرت تفکیک بالا (High resolution)
دستورالعمل/روش کشت معمولی شامل ۳ نوع کشت است:
۱-کشت مستقیم (direct)
2-کشت کوتاه مدت (معمولا ۲۴، ۴۸ و یا ۷۲ ساعته)
3-کلسمید در طول شب (overnight culture,ONC)
دستورالعمل/پروتکل کشت مستقیم (direct)
100µl کلسمید به لوله کشت حاوی محیط کشت کامل و نمونه اضافه کرده و در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد، به مدت ۱-۵/. ساعت انکوبه نموده، و سپس مرحله هاروست کنید.
نکته: این نوع کشت برای موارد لنفوم ولوسمی M2) ALM و M3) مناسب نیست.
دستورالعمل/کشت کوتاه مدت، ۲۴ ساعته، ۴۸ ساعته، ۷۲ ساعته:
در این مرحله کاری که باید انجام دهیم این است که ابتدا لوله های کشت ۲۴، ۴۸، ۷۲ ساعته، که در دمای ۳۷ درجه انکوبه کردیم 100µl کلسمید اضافه کرده و پس از ۵/. ساعت مرحله هاروست نمائید.
دستورالعمل/روش کار کشت کلسمید در طول شب (ONC)
بیست میکرولیتر 20µl کلسمید به لوله کشت در ساعت ۶-۵ بعد از ظهر اضافه کرده و اول صبح روز بعد مرحله هاروست کنید.
کشت موارد خاص
کشت برای تحریک تقسیم رده های سلولی B
درموارد لوسمی CLL و یا لنفوم از نوع رده سلولی B بایداز میتوژن های تحریک کننده تقسیم رده سلولی B استفاده نمود. البته توجه کنید که میتوژن PWM علاوه بر سلول های نوع B،محرک تقسیم سلول های نوع Tنیز می باشد.
کشت برای تحریک رده های سلولی: T
درموارد لوسمی CLL و یا لنفوم ازنوع رده سلولی T، از میتوژن فیتوهماگلوتینین(PHA) می شود استفاده کرد.
پروتکل/دستورالعمل کشت با قدرت تفکیک بالا (HR)
برای بدست آوردن کروموزومهای بلند تر و با شکل واضح تر ، سیکل سلولی را در مرحله S با یک مهارکننده مانند methotrexate( MTX), flurodeoxyuridine (FdU) و یا fdU همراه با bromodeoxyuridne (BrdU) متوقف کنید. حتی در مواردی هم از تایمیدین استفاده کنید و پس از ۱۷_۱۴ ساعت مهارکننده را از شستشو برداشته و پس از ۷_۴ ساعت هاروست را انجام دهید. شروع هاروست را با اضافه کردن کلسمید انجام دهید، و مدت زمان انکوبه در ۳۷ درجه ۲۰_۱۵ دقیقه باشد. مشکلات این روش کاهش تعداد متافاز به علت اثر سمی بلوک کننده ها می باشد.
دستورالعمل/پروتکل HR با استفاده از MTX:
مواد مورد نیاز:
محیط کشت کامل
محیط کشتی که حاوی ۵درصد سرم
محلول MTX
محلول تایمیدین
محلول کلسمید
دستورالعمل/روش کار
1-در مرحله اول نمونه مغز استخوان را کشت دهید.
2-لوله ها را به مدت ۳ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه کنید. در واقع این کار باعث آماده شدن سلول ها برای تاثیر MTX می شود.
3-در ادامه مقدار MTX0.1ml به لوله ها اضافه کنید و بعد آنها را در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۱۷_۱۴ ساعت انکوبه کنید.
4- لوله ها را به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ، و سپس 5ml محیط کشت (حاوی ۵ درصد سرم) به منظور شستشوی سلول ها اضافه کنید، و محتوی لوله ها را خوب مخلوط کنید.
5- به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ نمائید.
6-لایه رویی را بردارید، رسوب را خوب مخلوط کنید، و مجددا 5ml محیط کشت کم سرم، اضافه نموده و محتوی لوله را خوب مخلوط کنید.
7-مقدار0.1ml تایمیدین به لوله اضافه کنید، و به مدت ۷_۵ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه نمائید.
8-دراین مرحله صد میکرو لیتر (100µl) کلسمید با غلظت 10µg/mlبه لوله اضافه کنید، و به مدت ۱۵ دقیقه انکوبه نمائید.
9-در مرحله آخر طبق پروتکل خون ، هاروست کنید.
دستورالعمل/پروتکل HR با استفاده از( FdU) Fluorodeoxyyuridin
مواد مورد نیاز
محیط کشت کامل BM
محلول فلورودی اکسی یوردیدن (FdU)
محلول یوریدین
محلول کلسمید
محلول تایمیدین
نکته مهم :انتخاب نوع کشت بستگی به لوسمی دارد، به عنوان مثال در لوسمی پرومیلوستیک حاد(APML) جابجائی کروموزومی بین کروموزوم های 17/15 فقط در کشت های ۲۴ ساعته و یا طولانی تر مشاهده می شود، و کشت مستقیم (direct) لازم نیست. همچنین برای بیماران مبتلا به لنفوم، بایستی از میتوژن مناسبی استفاده نمود.
پروتکل/دستورالعمل /HR مغز استخوان
1-طبق معمول کشت دهید
2-ساعت ۳ بعد از ظهر، مقدار50µl یوریدین و FdU 50µl اضافه کنید، خوب مخلوط کنید و داخل انکوباتور قرار دهید.
3-سپس ۱۷ ساعت بعد، یعنی ۸ صبح روز بعد، مقدار100µl تایمیدین مخصوص BM اضافه و داخل انکباتور قرار دهید. و بالاخره ۴ ساعت و ۴۵ دقیقه بعد، مقدار 100µl کلسمید اضافه، و ۱۵ دقیقه بعد، هاروست کنید.
پروتکل/دستورالعمل استفاده از دی اکسی سایتیدین
تمامی مراحل شبیه به قبل می باشد. با این تفاوت که روز قبل از هاروست، ساعت ۱۴:۳۰ به میزان ۱۰۰ میکرو لیتر دی اکسی تایمیدین به نمونه ها اصافه کنید، و روز هاروست، ساعت ۸ صبح، ۱۰۰ میکرولیتر دی اکسی سایتیدین به نمونه ها اضافه شود و سپس ۵ ساعت بعد، هاروست آغاز می شود ( نحوه هاروست هیچگونه تغییری ندارد).