تکنیک ایمونوهیستوشیمی (IHC) فرآیند شناسایی انتخابی آنتی ژن ها (پروتئین ها) داخل سلول های بخشی از بافت با استفاده از آنتی بادی هایی که به طور اختصاصی به آنتی ژن های سلول ها در بافت های بیولوژیکی متصل می شوند. ایمونوهیستوشیمی نام خودش را از دو واژه ی (Immuno) که به آنتی بادی های مورد استفاده برمی گردد و (histo) به معنی بافت گرفته است.
درسال ۱۹۴۱ Albert Coons موفق شد برای اولین بار این روش را ابداع و اجرایی کند. رنگ آميزی ايمونوهيستوشيمی در تشخيص سلول های غير طبيعی مثل سلول های موجود در تومورهای سرطانی بطور گسترده ای مورد استفاده قرار می گيرد. نشانگرهای مولکولی خاص می توانند حوادث سلولی ویژه ای را مثل تکثیر یا مرگ سلولی(آپوپتوز) مشخص کنند.
علاوه بر این از ایمونوهیستوشیمی برای مشخص کردن جایگاه و پراکندگی بیومارکرها و بیان پروتئین های متفاوت در بخش های مختلف بافت های بیولوژیکی استفاده می شود. اما چطور می شود این واکنش بین آنتی ژن و آنتی بادی را طوری طراحی کرد که قابل ردیابی باشد و دیده شود؟
تجسم تعامل آنتی بادی-آنتی ژن را از چند طریق می شود انجام داد. رایج ترین روش این است که، یک آنتی بادی به آنزیمی مثل پراکسیداز کونژوگه شود که می تواند یک واکنش تولید کننده رنگ را کاتالیز کند، از طرف دیگر، می شود آنتی بادی را به یک فلوروفور، مثل فلورسئین یا رودامین هم متصل کرد.
برای ایمونوهیستوشیمی آماده سازی نمونه مهم است. لازم است که مورفولوژی سلول، ساختار بافت و آنتی ژنیسیتی اپی توپ های هدف حفظ شود .این امر به جمع آوری، تثبیت و برش مناسب بافت نیاز دارد. محلول پارافورمالدئید اغلب برای فیکس و تثبیت بافت استفاده می شود، اما روش های دیگری هم ممکن است استفاده شوند.
بسته به هدف آزمایش یا نوع بافت، ممکن است بافت مورد نظر برش داده شود و یا به طور کامل استفاده شود. قبل از برش، نمونه بافت داخل یک محیط همانند موم پارافین یا کرایو مدیا قرار داده می شود. قطعات را می شود بر روی انواع سازه ها مثلا میکروتوم، کرایوستات یا ویبراتوم برش داد.
نمونه ها به طور معمول در محدوده 3 تا 5 میکرومتر قطعه قطعه می شوند. برش ها بر روی اسلایدها سوار می شوند، و با استفاده از شستشوی الکل با غلظت های افزایشی (یعنی به ترتیب 50٪ ، 75٪ ، 90٪ ، 95٪ ، 100٪) آب موجود در نمونه از بین می رود و پاک می شود. قبل از تصویربرداری در زیر میکروسکوپ باید از مواد شوینده مثل زایلن استفاده کرد.
بسته به روش تثبیت و حفظ بافت، ممکن است نمونه اقدامات اضافی لازم داشته باشد تا اپی توپ ها برای اتصال به آنتی بادی در دسترس قرار بگیرند. مثلا دپارافینیزاسیون یعنی حذف پارافین و بازیابی آنتی ژن ها از اقدامات معمول به حساب می آید. برای بافت های تثبیت شده در فرمالین که در پارافین قرارگرفتن، بازیابی آنتی ژن اغلب ضروری است و شامل تیمار با گرما یا پروتئیناز می شود. این مراحل ممکن است باعث تفاوت بین رنگ آمیزی یا عدم رنگ آمیزی آنتی ژن های هدف شود.
در مرحله ی بعدی باید رنگ آمیزی های غیر اختصاصی ایمونو را حذف کنیم. بسته به نوع بافت و روش تشخیص آنتی ژن، ممکن است از بیوتین اندوژنز یا آنزیم هایی به ترتیب برای مسدود یا خاموش کردن قبل از رنگ آمیزیِ آنتی بادی استفاده شود.
اگرچه آنتی بادی ها دارای درجه خلوص ترجیحی برای اپی توپ های خاص هستند، و ترجیحشان برای اتصال به اهداف مشخصشان بیشتر است اما ممکن است به طور جزئی یا ضعیف به سایت هایی در پروتئین های غیر اختصاصی متصل شوند (که به آن مکان های واکنشی هم گفته می شود) که مشابه سایت های اتصال دهنده مربوط به آنتی ژن هدف هستند. اتصال غیر اختصاصی در مقادیر بالا، باعث رنگ آمیزی زیاد پس زمینه می شود که شناسایی آنتی ژن هدف را با مشکل مواجه می کند.
برای کاهش رنگ آمیزی پس زمینه در ایمونوسیتوشیمی (IHC)، ICC و سایر روش های رنگ آمیزی ایمنی، نمونه ها با یک بافر انکوبه می شوند که سایت های واکنشی را که آنتی بادی های اولیه یا ثانویه ممکن است به آن ها متصل شوند، مسدود می کنند. بافرهای مسدود کننده معمول شامل سرم نرمال، شیر خشک بدون چربی، BSA یا ژلاتین است. البته بافرهای مسدود کننده تجاری با فرمولاسیون اختصاصی برای بهره وری بیشتر در دسترس هستند.
روش های از بین بردن رنگ آمیزی پس زمینه شامل رقیق شدن آنتی بادی های اولیه یا ثانویه، تغییر زمان یا دمای انکوباسیون و استفاده از سیستم تشخیص متفاوت یا آنتی بادی اولیه ی متفاوت است.
انجام تست کنترل مثبت (آزمایش بر روی بافت شناخته شده ای که آنتی ژن خاص را بیان می کند) و کنترل منفی (آزمایش بر روی بافت شناخته شده ای که آنتی ژن خاص را بیان نمی کند) باید انجام شود.
کاربرد رنگ آمیزی تکنیک ایمونوهیستوشیمی در آزمایشگاه سلولی
این تکنیک در تشخیص سلول های غير طبيعی مثل سلول هاي موجود در تومورهای سرطانی بطور گسترده ای مورد استفاده قرار می گيرد. نشانگرهای مولکولی خاص می توانند حوادث سلولی ویژه ای را مثل تکثیر یا مرگ سلولی (آپوپتوز) مشخص کنند. علاوه بر این از ایمونوهیستوشیمی برای مشخص کردن جایگاه و پراکندگی بیومارکر ها و بیان پروتئین های متفاوت در بخش های مختلف بافت های بیولوژیکی استفاده می شود.
یکی از مهم ترین و شاید اساسی ترین مراحل ایمونوهیستوشیمی نشان دار کردن نمونه است. آنتی بادی های مورد استفاده برای تشخیص یک سایت ویژه می توانند پلی کلونال(چند قطبی) یا مونوکلونال باشند. آنتی بادی های پلی کلونال با تزریق پروتئینی خاص یا قطعه ی پپتیدی به حیوانات ساخته می شوند و بعد از تحریک پاسخ ایمنی ثانویه ، آنتی بادی ها را از سرم جدا می کنند. برای همین، آنتی بادی های پلی کلونال ترکیبی ناهمگن از آنتی بادی ها هستند که چند تا اپی توپ مختلف را تشخیص می دهند.
آنتی بادی های مونوکلونال با تزریق حیوان و بعد از آن گرفتن نمونه مشخصی از بافت ایمنی بدن، جداسازی یک سلول والد و استفاده از لاین نامیرای حاصل از آن سلول برای ایجاد آنتی بادی ساخته می شوند. این باعث می شود که آنتی بادی ها بصورت اختصاصی یک اپی توپ خاص را مشخص کنند.
در استراتژی های تشخیص ایمونوهیستوشیمی، آنتی بادی ها به عنوان معرف های اولیه یا ثانویه طبقه بندی می شوند. آنتی بادی های اولیه روی آنتی ژن مورد نظر سوار شده و معمولا به عنوان نشانگر عمل نمی کنند، اما آنتی بادی های ثانویه روی ایمونوگلوبولین های گونه های آنتی بادی اولیه سوار می شوند. آنتی بادی ثانویه معمولاً به یک مولکول پیوند دهنده مثل بیوتین کونژوگه می شود که بعدا مولکول های گزارشگر را جذب می کند، یا خود آنتی بادی ثانویه مستقیماً به مولکول گزارشگر وصل می شود.
برای یادگیری تکنیک ایمونوهیستوشیمی و سایر تکنیک های مورد نیاز برای آزمایشگاه کشت سلول
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.
گزارشگرها در تکنیک ایمونوهیستوشیمی چه ویژگی هایی دارند؟
مولکول های گزارشگر بر اساس ماهیت روش تشخیصی شان متفاوت هستند که رایج ترین آن ها روش کروموژنیک و روش تشخیص فلورسانس به واسطه آنزیم یا یک فلوروفور است.
با گزارشگرهای کروموژنیک، یک آنزیم نشاندار شده با یک سوبسترا واکنش نشان می دهد تا محصولی به شدت رنگی تولید کند که با یک میکروسکوپ نوری معمولی قابل تجزیه و تحلیل باشد.در حالی که لیست سوبستراهای آنزیم گسترده است، آلکالین فسفاتاز (AP) و horseradish peroxidase (HRP) دو آنزیمی هستند که بیشتر به عنوان نشانگر برای تشخیص پروتئین مورد استفاده قرار می گیرند.
روش های شناسایی آنتی ژن هدف
روش مستقیم یک روش رنگ آمیزی تک مرحله ای است و شامل یک آنتی بادی نشاندار شده به عنوان مثال آنتی سرم کونژوگه شده (FITC) است که به طور مستقیم با آنتی ژن در قطعه های بافت واکنش نشان می دهد. در این روش از تنها یک آنتی بادی استفاده می شود و بنابراین روش ساده و سریعی است، اما برخلاف روش های غیرمستقیم، حساسیت آن کمتر است. با این حال، این استراتژی کمتر از روش چند فاز استفاده می شود.
روش غیر مستقیم شامل یک آنتی بادی اولیه بدون نشانگر (لایه اول) است که به آنتی ژن هدف در بافت متصل می شود و یک آنتی بادی ثانویه دارای نشانگر (لایه دوم) که با آنتی بادی اولیه واکنش نشان می دهد. همانطور که در بالا گفتیم، آنتی بادی ثانویه باید بر روی IgG گونه های جانوری که در آن آنتی بادی اولیه قرار گرفته، سوار شود. این روش نسبت به روش مستقیم حساسیت بیشتری دارد.
روش غیرمستقیم، جدا از حساسیت بیشتری که دارد، این مزیت را دارد که فقط باید تعداد نسبتاً کمی از آنتی بادی های ثانویه کونژوگه شده (نشانگر دار شده) استاندارد تولید شود. به عنوان مثال، یک آنتی بادی ثانویه دارای نشانگر سوار شده روی IgG خرگوش، که می شود آن را بصورت فوری تهیه کرد، با هر آنتی بادی اولیه ای که در خرگوش پرورش پیدا می کند مفید است. با روش مستقیم، لازم است هر آنتی بادی اولیه را برای هر آنتی ژن مورد نظر نشاندار کرد.
دستورالعمل/ روش رنگ آمیزی مستقیم و غیر مستقیم در تکنیک ایمونوهیستوشیمی
روش مستقیم یک روش رنگ آمیزی تک مرحله ای است و شامل یک آنتی بادی نشانگر دار شده (آنتی سرم کونژوگه شده FITC) است که به طور مستقیم با آنتی ژن در قطعه های بافت واکنش نشان می دهد. در این روش از تنها یک آنتی بادی استفاده می شود و بنابراین روش ساده و سریعی است، اما برخلاف روش های غیرمستقیم، حساسیت آن کمتر است. با این حال، این استراتژی کمتر از روش چند فاز استفاده می شود.
روش غیر مستقیم شامل یک آنتی بادی اولیه بدون نشانگر (لایه اول) است که به آنتی ژن هدف در بافت متصل می شود و یک آنتی بادی ثانویه دارای نشانگر (لایه دوم) که با آنتی بادی اولیه واکنش نشان می دهد. همانطور که در بالا گفتیم، آنتی بادی ثانویه باید روی IgG گونه های جانوری که در آن آنتی بادی اولیه قرار گرفته، سوار شود. این روش نسبت به روش مستقیم حساسیت بیشتری دارد.
در تکنیک های ایمونوهیستوشیمی چند مرحله قبل از رنگ آمیزی نهایی آنتی ژن بافت وجود دارد که می تواند مشکلات مختلفی مثل رنگ آمیزی پس زمینه قوی، رنگ آمیزی آنتی ژن هدف ضعیف و اتو فلورسانس ایجاد کند. بیوتین درونزا یا آنزیم های گزارشگر یا واکنش متقاطع آنتی بادی اولیه/ثانویه از دلایل اصلی رنگ آمیزی پس زمینه قوی هستند، در حالی که رنگ آمیزی ضعیف ممکن است بخاطر فعالیت ضعیف آنزیم یا قدرت اولیه آنتی بادی ایجاد شود.
علاوه بر این، اتو فلورسانس ممکن است بخاطر ماهیت بافت یا روش تثبیت باشد. این جنبه های آماده سازی بافت IHC و رنگ آمیزی آنتی بادی ها باید بطور منظم مورد بررسی قرار بگیرند که مشکلات رنگ آمیزی شناسایی و حل شوند.
برای دریافت خدمات مربوط به ایمونوهیستوشیمی و انجام انواع تست های آزمایشگاه کشت سلول
از طریق لینک خدمات آزمایشگاهی می توانید اقدام نمایید
نشانگرهای تشخیصی ایمونوهیستوشیمی
ایمونوهیستوشیمی یک روش تشخیص عالی است و از این مزیت فوق العاده برخوردارد که می تواند یک پروتئین معین در بافت مورد بررسی را دقیقاً مشخص کند. علاوه بر آن یک روش مؤثر برای بررسی بافت ها هم است. این امر آن را به یك روش گسترده در علوم اعصاب تبدیل كرده و به محققان کمک می کند كه بیان پروتئین در ساختارهای خاص مغز را بررسی كنند.
نقطه ضعف اصلی IHC این است که، برخلاف تکنیک های سیستم ایمنی که رنگ آمیزی با یک نردبان(Ladder) با وزن مولکولی مشخص بررسی می شود، نمی توانیم در IHC نشان دهیم که رنگ آمیزی با پروتئین مورد نظر مطابقت دارد. به همین دلیل، آنتی بادی های اولیه باید به روش وسترن بلات یا روشی مشابه به خوبی تأیید شوند. این روش حتی بیشتر در آسیب شناسی جراحی تشخیصی برای تومورهای ایمنی استفاده می شود، مثلا برای e-cadherin برای تمایز بین DCIS و LCIS.
تکنیک های ایمونوهیستوشیمی در تشخیص افتراقی اشکال مختلف سرطان غدد بزاقی، سر و گردن مفید هستند. تنوع مارکرهای IHC مورد استفاده در آسیب شناسی جراحی تشخیصی زیاد است. خیلی از آزمایشگاه های بالینی در بیمارستان ها بیش از 200 آنتی بادی دارند که به عنوان نشانگرهای زیستی تشخیصی، پیش آگهی و پیش بینی کننده مورد استفاده قرار می گیرند. نمونه هایی از برخی نشانگرهایی که معمولاً استفاده می شوند عبارتند از:
نشانگر BrdU: برای شناسایی سلول های در حال تکرار استفاده می شود. برای شناسایی تومورها و همین طور در تحقیقات نوروساینس استفاده می شود.
سیتوکراتین ها: برای شناسایی کارسینوما استفاده می شود اما ممکن است در بعضی از سارکوم ها هم بیان شود.
CD15 و CD30: برای بیماری هوچکین استفاده می شود
Alpha fetoprotein: برای تومورهای کیسه زرده و سرطان سلول های کبدی کاربرد دارد
CD117 (KIT): برای تومورهای استرومایی دستگاه گوارش (GIST) و تومورهای ماست سل
CD10 (CALLA): برای سرطان سلول کلیوی و لوسمی لنفوبلاستیک حاد
آنتی ژن اختصاصی پروستات (PSA): برای سرطان پروستات شناسایی لنفوم های B-cell با استفاده از CD20 شناسایی لنفوم های T-cell با استفاده از CD3.
انواع مسیرهای مولکولی در سرطان تغییر پیدا می کنند و بعضی از تغییرات ممکن است در درمان سرطان هدف گیری شوند. از ایمونوهیستوشیمی می شود برای ارزیابی اینکه تومورها با تشخیص حضور یا افزایش سطح مولکول هدف، به درمان پاسخ می دهند، استفاده کرد. بسیاری از تومورها وابسته به هورمون هستند.
وجود گیرنده های هورمونی می تواند مورد استفاده قرار بگیرد تا مشخص شود آیا تومور به طور بالقوه به درمان ضد هورمونی پاسخ می دهد یا خیر. یکی از اولین روشهای درمانی ضد استروژن، تاموکسیفن بود که برای درمان سرطان سینه مورد استفاده قرار می گرفت. چنین گیرنده های هورمونی را می شود با ایمونوهیستوشیمی تشخیص داد.
ایماتینیب (Imatinib)، یک مهار کننده تیروزین کیناز داخل سلولی، برای درمان لوسمی میلوژن مزمن، یک بیماری که با تشکیل تیروزین کیناز غیر طبیعی تشخیص داده می شود، ایجاد شد. Imatinib در تومورهایی که بیانگر سایر تیروزین کینازها هستند، مؤثرتر از KIT است. بیشتر تومورهای استرومایی دستگاه گوارش KIT را بیان می کنند که با ایمونوهیستوشیمی قابل شناسایی است.
بیشتر بخوانید:
واقعاااااااا عالی بود
سپاس از توجه شما