✍ رایج ترین تکنیک رنگ آمیزی ایمونولوژیک

تکنیک ایمونوهیستوشیمی (IHC) فرآیند شناسایی انتخابی آنتی ژن ها (پروتئین ها) داخل سلول های بخشی از بافت با استفاده از آنتی بادی هایی که بطور اختصاصی به آنتی ژن های سلول ها در بافت های بیولوژیکی متصل می شوند. ایمونوهیستوشیمی نام خودش را از دو واژه ی (Immuno) که به آنتی بادی های مورد استفاده برمی گردد و (histo) به معنی بافت گرفته است.

درسال ۱۹۴۱ Albert Coons موفق شد برای اولین بار این روش را ابداع و اجرایی کند. رنگ آميزی ايمونوهيستوشيمی در تشخيص سلول های غير طبيعی مثل سلول های موجود در تومورهای سرطانی بطور گسترده ای مورد استفاده قرار می گيرد. نشانگرهای مولکولی خاص می توانند حوادث سلولی ویژه ای را مثل  تکثیر یا مرگ سلولی(آپوپتوز) مشخص کنند. علاوه بر این از ایمونوهیستوشیمی برای مشخص کردن جایگاه و پراکندگی بیومارکر ها و بیان پروتئین های متفاوت در بخش های مختلف بافت های بیولوژیکی استفاده می شود. اما چطور می شود این واکنش بین آنتی ژن و آنتی بادی را طوری طراحی کرد که قابل ردیابی باشد و دیده شود؟

تجسم تعامل آنتی بادی-آنتی ژن را از چند طریق می شود انجام داد. رایج ترین روش  این است که، یک آنتی بادی به آنزیمی مثل پراکسیداز کونژوگه می شود که می تواند یک واکنش تولید کننده رنگ را کاتالیز کند  رنگ آمیزی ایمونوپراکسیداز از طرف دیگر، می شود آنتی بادی را به یک فلوروفور، مثل فلورسئین یا رودامین هم متصل کرد.

برای ایمونوهیستوشیمی آماده سازی نمونه مهم است. لازم است که مورفولوژی سلول، ساختار بافت و آنتیژنیسیتی اپیتوپ های هدف حفظ شود .این امر به جمع آوری، تثبیت و برش مناسب بافت نیاز دارد. محلول پارافورمالدئید اغلب برای فیکس و تثبیت بافت استفاده می شود، اما روش های دیگری هم ممکن است استفاده شوند.

بسته به هدف آزمایش یا نوع بافت، ممکن است بافت مورد نظر برش داده شود و یا به طور کامل استفاده شود. قبل از برش، نمونه بافت داخل یک محیط همانند موم پارافین یا کرایو مدیا قرار داده می شود. قطعات را می شود بر روی انواع سازه ها مثلا میکروتوم، کرایوستات یا ویبراتوم  برش داد. نمونه ها به طور معمول در محدوده ۳ تا ۵ میکرومتر قطعه قطعه می شوند. برش ها بر روی اسلایدها سوار می شوند، و با استفاده از شستشوی الکل با غلظت های افزایشی ( یعنی به ترتیب ۵۰٪ ، ۷۵٪ ، ۹۰٪ ، ۹۵٪ ، ۱۰۰٪) آب موجود در نمونه از بین می رود و پاک می شود. قبل از تصویربرداری در زیر میکروسکوپ باید از مواد شوینده مثل زایلن استفاده کرد.

بسته به روش تثبیت و حفظ بافت، ممکن است نمونه اقدامات اضافی لازم داشته باشد تا اپی توپ ها برای اتصال به آنتی بادی در دسترس قرار بگیرند. مثلا دپارافینیزاسیون یعنی حذف پارافین و بازیابی آنتی ژن ها از اقدامات معمول به حساب می آید. برای بافت های تثبیت شده در فرمالین که در پارافین قرارگرفتن، بازیابی آنتی ژن اغلب ضروری است و شامل تیمار با گرما یا پروتئیناز می شود. این مراحل ممکن است باعث تفاوت بین رنگ آمیزی یا عدم رنگ آمیزی آنتی ژنهای هدف شود.

در مرحله ی بعدی باید رنگ آمیزی های غیر اختصاصی ایمونو را حذف کنیم. بسته به نوع بافت و روش تشخیص آنتی ژن، ممکن است از بیوتین اندوژنز یا آنزیم هایی به ترتیب برای مسدود یا خاموش کردن قبل از رنگ آمیزیِ آنتی بادی استفاده شود. اگرچه آنتی بادی ها دارای درجه خلوص ترجیحی برای اپی توپ های خاص هستند، و ترجیحشان برای اتصال به اهداف مشخصشان بیشتر است اما ممکن است  به طور جزئی یا ضعیف به سایت هایی در پروتئین های غیر اختصاصی متصل شوند (که به آن مکان های واکنشی هم گفته می شود) که مشابه سایت های اتصال دهنده مربوط به آنتی ژن هدف هستند. اتصال غیر اختصاصی در مقادیر بالا، باعث رنگ آمیزی زیاد پس زمینه می شود که شناسایی آنتی ژن هدف را با مشکل مواجه می کند. برای کاهش رنگ آمیزی پس زمینه در IHC ، ICC و سایر روشهای رنگ آمیزی ایمنی، نمونه ها با یک بافر انکوبه می شوند که سایتهای واکنشی را که آنتی بادی های اولیه یا ثانویه ممکن است به آن ها متصل شوند ، مسدود می کنند.  بافرهای مسدود کننده معمول شامل سرم نرمال، شیر خشک بدون چربی،  BSAیا ژلاتین است. البته بافرهای مسدود کننده تجاری با فرمولاسیون اختصاصی برای بهره وری بیشتر در دسترس هستند. روش های از بین بردن رنگ آمیزی پس زمینه شامل رقیق شدن آنتی بادی های اولیه یا ثانویه، تغییر زمان یا دمای انکوباسیون و استفاده از سیستم تشخیص متفاوت یا آنتی بادی اولیه ی متفاوت است.

انجام تست کنترل مثبت ( آزمایش برروی بافت شناخته شده ای که آنتی ژن خاص را بیان می کند) و کنترل منفی (آزمایش برروی بافت شناخته شده ای که آنتی ژن خاص را بیان نمی کند) باید انجام شود.

تکنیک ایمونوهیستوشیمی (IHC) – بخش اول

تکنیک ایمونوهیستوشیمی (IHC )– بخش دوم

تکنیک ایمونوهیستوشیمی (IHC )– بخش سوم